Vorbeugende Maßnahmen

1. Verstopfungen vermeiden

Kleine Mikropartikel sollten unbedingt in der HPLC vermieden werden. Diese führen unweigerlich zum Verstopfen der Kapillaren, Ventile oder der Trennsäule. Letzteres ist am ärgerlichsten, da dies im Normalfall mit dem Austausch der Säule und somit mit hohen Kosten verbunden ist. Die Proben sollten daher immer mit z. B. einem geeigneten Spritzenvorsatzfilter filtriert werden. Wichtig ist, dass die Standards ebenso filtriert werden, da es vorkommen kann, dass das Filtermaterial einige Analyten absorbiert und es ansonsten zu Unterbefunden kommen kann.

Besonders vorsichtig sollte man bei rein wässrigen Eluenten sein, da sich hier Mikroorganismen vermehren können. Diese können ebenso zu Verstopfungen im System führen. Daher empfiehlt es sich, den Eluenten regelmäßig zu erneuern und am besten immer frisch für den Analysentag ansetzen.

Bei der Verwendung von Puffern ist auf die Mischbarkeit mit organischen Lösungsmitteln zu achten. Ab einem bestimmten Prozentsatz kann es bei einigen Puffern zu Ausfällungen kommen und so unweigerlich zum Verstopfen des Systems führen. Vortests der Mischbarkeit sind daher empfehlenswert.

2. Spülen

Verunreinigungen der Flusslinie oder der Säule können einen großen Einfluss auf die Chromatographie haben. Ist die Säule nicht sauber, kann der Rückdruck stark ansteigen oder sich die Selektivität der stationären Phase nachhaltig ändern. Enthalten die Proben eine sehr komplexe Probenmatrix, sollte in jeder Methode ein Spülschritt implementiert werden. Sollte die Säule dennoch einmal sehr verdreckt sein, kann diese zum längeren Spülen direkt an eine externe Pumpe angeschlossen werden. Sie können auch Ihr HPLC-System verwenden, aber achten sie darauf den Säulenausgang mit einer Kapillare in ein Abfallgefäß zum Auffangen der Spüllösung zu hängen. So gelangen die Verunreinigungen nicht auf die Detektoren Ihres Systems, damit vermeiden Sie weitere nachfolgende Fehlerquellen. Die Flusslinie des Systems kann mit geeigneten Lösungsmitteln ohne Säule und einer Gegendruckkapillare gespült werden. Ob eine Säule rückwärts gespült werden darf, erfragen Sie bitte bei dem jeweiligen Säulenhersteller. Nicht jede Säule ist dafür geeignet und sie könnte beim Rückspülen gegebenenfalls zerstört werden.

3. Entgasen

In der mobilen Phase gelöste Luft hat einen großen Einfluss auf die Basislinienstabilität und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Das Bild auf der rechten Seite zeigt den Einfluss von gelöster Luft in Wasser und THF auf die Basislinie eines Brechnungsindex-Detektors (RID).

Zusätzlich kann es bei viel gelöster Luft, ähnlich wie bei einer Wasserflasche zum Freisetzen von Luftblasen kommen, die zu Druckschwankungen und Fehlern in der Chromatographie führen können. Daher ist das vorherige Entgasen der Eluenten oder die Verwendung eines im HPLC-System integrierten Online-Degassers zu empfehlen.

4. Temperieren

Die Temperatur ist ein großer Punkt in der HPLC, da diese maßgeblich unsere Chromatographie oder die Empfindlichkeit der Detektoren beeinflusst. Mit zunehmender Temperatur der Säule verringert sich die Viskosität der Eluenten, der Druck sinkt und die Retentionszeiten verändern sich. Ähnlich verhält es sich mit den Detektoren. Je nach Temperatur verändert sich die Sensitivität, und Schwankungen der Raumtemperatur haben ebenso Schwankungen der Basislinie zur Folge. Daher sollten Sie, wenn möglich, Ihr System temperaturstabil halten. Dies erreichen Sie durch einen Säulenofen, beheizbare Detektorzellen und die richtige Wahl des Aufstellortes. Vermeiden Sie Orte mit zu stark schwankenden Umgebungstemperaturen, zu viel Luftzug, z. B. unter einer Klimaanlage oder in direkter Sonneneinstrahlung.

5. Detektoreinstellungen

Ein oft vernachlässigter Punkt ist unter anderem die Datenaufnahmerate des Detektors. Wird diese falsch gewählt, kann es zu erheblichen Schwankungen in der Peakfläche kommen. Dabei sollte die Datenaufnahmerate der Chromatographie an die Peakbreite des schmalsten Peaks angepasst werden. Ist sie zu klein, wird der Peak nicht reproduzierbar abgebildet. Ist sie zu groß, ist ein erhöhtes Rauschen die Folge. Um einen optimalen gaußförmigen Peak zu beschreiben, sind daher mindestens 20 Datenpunkte notwendig.

Wenn Sie diese fünf Punkte beachten, werden Sie einige Fehler im Vorfeld vermeiden. Zur Beurteilung Ihres Systems ist es weiterhin sinnvoll, regelmäßig geeignete Systemtests durchzuführen. Anhand dessen können Sie dann die Leistungsfähigkeit Ihres Systems und der Säule beurteilen und einschleichende Fehler schneller erkennen.

In der kommenden Kurseinheit starten wir mit dem ersten „Problem“ – den Störungen der Basislinie.

Ihr Shimadzu Deutschland LC-Team