LC-MS/MS Methodenpaket zur Fettsäureanalyse
Dieses Methodenpaket ermöglicht eine gezielte Analytik von kurzkettigen Fettsäuren und anderen organischen Säuren
Die von der Darmflora produzierten kurzkettigen Fettsäuren wie Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure sind gut bekannt. Ebenso verstanden ist der Zusammenhang zwischen diesen Fettsäuren und bestimmten, lebensstilbedingten Krankheiten, wie Fettleibigkeit und Diabetes. Eine zuverlässige Quantifizierung solcher Metaboliten hilft dabei Stoffwechselerkrankungen zu erkennen und zu vermeiden. Allerdingt ist aufgrund der hohen Flüchtigkeit und der Hydrophilie kurzkettiger Fettsäuren die konventionelle LC-MS-Analytik mittels klassischer Umkehrphasenchromatographie recht schwierig. Daher werden in diesem Methodenpaket MRM-Übergänge von Fettsäuren (C2-C5) verwendet, die zuvor mit 3-Nitrophenylhydrazin (3-NPH) derivatisiert werden. So können simultan 22 Komponenten analysiert werden, inklusive einiger im Metabolismus involvierter organischer Säuren.
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Derivatisierung
3-Nitrophenylhydrazin reagiert mit Carbonsäuren und weiteren funktionellen Keto-Gruppen, so dass die Derivatisierung mit dieser Reagenz eine ideale Grundlage zur Analyse von Fettsäuren und anderen organischen Säuren darstellt. Die massenspektrometrische Erfassung der spezifischen Fragmente solcher 3-NPH-Derivate ist hierbei sehr selektiv und die Derivate der Zielanalyten lassen sich zudem im Vergleich zu den unbehandelten Säuren chromatographisch sehr viel besser voneinander trennen.
Von der Probenvorbereitung über die Datenaufnahme bis hin zur Datenanalyse
Das benötigte Protokoll zur Probenvorbereitung, einschließlich der Derivatisierung, ist in dem Methodenpaket enthalten. Damit umfasst das Methodenpaket die vollständige Analyse kurzkettiger Fettsäuren von der Derivatisierung über die Datenaufnahme einschließlich optimierter MRM-Übergänge bis hin zur Auswertung der Daten.
Die Reaktion der Derivatisierung von 3-NPH findet unter milden Bedingungen statt. Als Kondensationsreagenz wird Carbodiimid eingesetzt. Ein Vorteil gegenüber der konventionellen Derivatisierung mittels 2-NPH, liegt in der Stabilität des 3-NPH Derivats nach Reaktionsablauf. Somit eignet sich die Methode zur Quantifizierung der untersuchten Verbindungen. Zusätzlich findet die Reaktion in wässriger Lösung statt, wodurch eine Austrocknung oder ein Verdampfen der flüchtigen Komponenten vermieden wird und dementsprechend kein Probenverlust entsteht.
Derivatization Reaction with 3-nitrophenylhydrazine (3-NPH)
Im folgenden Beispiel ist eine Analyse mit dem Shimadzu LCMS-8060 einer Standard-Lösung aus kurzkettigen Fettsäuren und organische Säuren gezeigt. Das hier dargestellte MRM-Chromatogramm wurde nach der Derivatisierung der kurzkettigen Fettsäuren und organische Säuren mit 3-NHP aufgenommen und zeigt die chromatographische Trennung von Komponenten wie Buttersäure, Isobuttersäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Citronensäure und Isocitronensäure.
Fazit: Das Methodenpaket ermöglicht die simultane Analyse von sowohl kurzkettigen Fettsäuren (C2 bis C5) und von organischen Säuren, die in dem zentralen Metabolismus eine entscheidende Rolle spielen.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.