Übersicht über HPLC: Was ist HPLC?

HPLC ist eine Abkürzung für Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography). Die "Chromatographie" ist die Technik zur Trennung, ein "Chromatogramm" ist das Ergebnis der Chromatographie, und der "Chromatograph" ist das Instrument, das zur Durchführung verwendet wird.

Von den Technologien, die für die Chromatographie entwickelt wurden, gehören die so genannten Säulen (die zur Molekulartrennung bestimmten Bauteile) und die Hochleistungspumpen (die das Lösungsmittel mit einer stabilen Durchflussrate befördern), zu den Schlüsselkomponenten. Da die verwandten Technologien ausgefeilter wurden, wurde das System, das bisher als Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bezeichnet wurde, einfach als "LC" bekannt. Heutzutage hat sich auch die Ultra Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (UHPLC), die besonders schnelle Analysen ermöglicht, weiter verbreitet.

Nur Verbindungen, die sich in Lösungsmitteln lösen lassen, können mit HPLC analysiert werden. Die HPLC trennt diese in einer flüssigen Probe gelösten Verbindungen und ermöglicht ihre qualitative und quantitative Analyse. Sie zeigt also, welche Komponenten und wie viel von jeder Komponente in der Probe enthalten sind.

Abb. 1 zeigt eine grundlegende Übersicht über den HPLC-Prozess. Das Lösungsmittel, das zur Trennung von Komponenten in der HPLC-Analyse verwendet wird, wird als mobile Phase bezeichnet. Die mobile Phase wird zu einer Trennsäule, die auch als stationäre Phase bekannt ist, und dann zum Detektor geleitet. Dies geschieht bei einer stabilen Flussrate, die von der Lösungsmitteldosierpumpe gesteuert wird. Es wird eine bestimmte Menge der Probe in die Säule injiziert und die in dieser Probe enthaltenen Verbindungen werden getrennt. Die in der Säule getrennten Verbindungen werden schließlich von einem Detektor am Ende der Säule erkannt, und jede Verbindung wird identifiziert und quantifiziert.

2　Das Gerät der HPLC

Die „Grundübersicht über den HPLC-Prozess“ (wie in Abb. 1 gezeigt) und seine Mechanismen wurden nun behandelt. Im Detail betrachtet besteht die HPLC aus einer Vielzahl von Komponenten, einschließlich einer Lösungsmitteldosierpumpe, einer Degasierungseinheit, einem Probeninjektor, einem Säulenofen, einem Detektor und einem Datenprozessor. Abb. 2 zeigt das HPLC-Flussdiagramm sowie die Rolle jeder Komponente.

Abb. 2　HPLC-Flussdiagramm

 

Bei der HPLC befördert die Pumpe die mobile Phase mit einer kontrollierten Flussrate (a). Luft kann sich unter dem Standardluftdruck, in dem wir leben, leicht in der mobilen Phase lösen. Wenn die mobile Phase Luftblasen enthält und in die Dosierpumpe gelangt, können Probleme wie Fluktuationen der Flussrate und Grundlinienrauschen/-drift auftreten. Die Degasierungseinheit hilft, dieses Problem zu verhindern, indem sie Luftblasen in der mobilen Phase entfernt (b). Nachdem die gelöste Luft entfernt wurde, wird die mobile Phase zur Säule gepumpt. Der Probeninjektor führt dann eine Standardlösung oder Probenlösung in die mobile Phase ein (c). Auch Temperaturschwankungen können die Trennung der Verbindungen in der Säule beeinflussen. Die Säule wird in einen Säulenofen gestellt, dieser hält die Temperatur konstant (d). Verbindungen, die aus der Säule eluieren, werden letztlich von einem Detektor erkannt, der nach der Säule platziert ist (e). Eine Workstation verarbeitet das Signal des Detektors. Sie erstellt ein Chromatogramm, um die Verbindungen zu identifizieren und zu quantifizieren (f).

3　HPLC-Trennung

HPLC kann jede Verbindung durch den Unterschied der Geschwindigkeit, mit der jede Verbindung durch die Säule fließt, trennen und nachweisen. Abb. 3 zeigt ein Beispiel für die HPLC-Trennung.

Es gibt zwei Phasen in der HPLC: die mobile Phase und die stationäre Phase. Die mobile Phase ist die Flüssigkeit, die die Zielverbindung löst. Die stationäre Phase ist der Teil einer Säule, der mit der Zielverbindung interagiert.

In der Säule gilt: Je stärker die Affinität (z.B. van-der-Waals-Kräfte) zwischen der Komponente und der mobilen Phase, desto schneller bewegt sich die Komponente zusammen mit der mobilen Phase durch die Säule. Andererseits gilt: Je stärker die Affinität zur stationären Phase, desto langsamer bewegt sie sich durch die Säule. Abb. 3 zeigt ein Beispiel, in dem die gelbe Komponente eine starke Affinität zur mobilen Phase hat und schnell durch die Säule fließt, während die pinke Komponente eine starke Affinität zur stationären Phase hat und langsam fließt. Die Elutionsgeschwindigkeit in der Säule hängt von der Affinität zwischen der Verbindung und der stationären Phase ab.

Abb. 3　Ein Beispiel für die HPLC-Trennung

4　Wie man ein Chromatogramm liest

Das Wort "Chromatogramm" bezeichnet ein Diagramm, das durch Chromatographie entsteht. Abb. 4 zeigt ein Beispiel für ein solches Chromatogramm. Das Chromatogramm ist ein zweidimensionales Diagramm, bei dem die vertikale Achse die Konzentration anhand der Intensität des Detektorsignals zeigt und die horizontale Achse die Analysezeit darstellt. Wenn keine Verbindungen aus der Säule eluieren, wird eine Linie parallel zur horizontalen Achse gezeichnet. Dies wird als Basislinie bezeichnet. Der Detektor reagiert basierend auf der Konzentration der Zielverbindung. Das erhaltene Diagramm hat eher die Form einer Glocke als die einer Dreiecksform. Diese Form wird als „Peak“ bezeichnet.

Die Retentionszeit (tR) ist das Zeitintervall zwischen der Probeninjektion und dem Gipfel des Peaks. Die benötigte Zeit für nicht-retinierte Verbindungen (Verbindungen ohne Interaktion mit der stationären Phase), um vom Injektor zum Detektor zu gelangen, wird als Totvolumen (t0) bezeichnet.

Die Peakhöhe (h) ist der vertikale Abstand zwischen dem Gipfel eines Peaks und der Basislinie. Die Peakfläche (A), die hellblau eingefärbt ist, ist die Fläche, die vom Peak und der Basislinie umschlossen wird. Diese Ergebnisse werden für die qualitative und quantitative Analyse einer Probe verwendet.

Abb. 4　Chromatogramm und verwandte Begriffe