Abnormale Peakformen
Haben Sie jemals während einer HPLC-Analyse eine Situation erlebt, in der Sie dachten: „Etwas stimmt nicht mit diesen Peakformen“? Abnormale Peakformen sind ein häufiges Problem bei der Durchführung von Routineanalysen. Deutlich erkennbare Peakanomalien in Chromatogrammen umfassen Peakverbreiterung (einschließlich extremem Tailing oder führenden Kanten), Schulterpeaks und gespaltene Peaks, wie in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Beispiele für abnormale Peakformen
Wenn eine dieser Peakanomalien in Chromatogrammen erscheint, können sie durch die in Abbildung 2 angegebenen Faktoren verursacht werden. Dieser Artikel behandelt die Hauptursachen für abnormale Peakformen.
Abbildung 2: Hauptursachen für abnormale Peakformen
Säulenschädigung
- Wenn die Peakformen immer mehr denen in Abbildung 1 ähnlich sehen, obwohl die Analyse auf übliche Weise durchgeführt wird, ist die wahrscheinlichste Ursache eine Säulenschädigung (einschließlich Kontamination). Wenn eine Guard-Säule vor der analytischen Säule installiert ist, überprüfen Sie die Peakform, nachdem die Guard-Säule entfernt wurde. Wenn die Peaks wieder normal sind, liegt das Problem bei der Guard-Säule.
- Säulenschädigung kann aufgrund einer Veränderung des Packungszustands der Säule, einer Ansammlung von Kontaminanten, Mikropartikelblockierungen, Desorption von der festen Phase oder anderen Faktoren auftreten. Der Packungszustand kann sich durch langfristige Druckbelastungen oder die Verschlechterung des Basisfüllmaterials ändern (z. B. durch Auflösung des Kieselgels). In vielen Fällen entsteht eine kleine Lücke im Füllmaterial am Säuleneingang, die Schulterpeaks oder gespaltene Peaks verursachen kann. Mikropartikelblockierungen (aus Probenlösungen, mobilen Phasen, Pumpen, Probeninjektionseinheiten usw.) oder Ansammlungen von Kontaminanten können in den Filtern auftreten, die am Eingang der Säulen oder im Packungsmaterial in der Nähe des Eingangs installiert sind. Die Adsorption von Probenkomponenten an Kontaminantenansammlungen oder Mikropartikeln, die den Fluss der Probenkomponenten behindern, kann die Peakformen verändern. Desorption von der festen Phase kann nicht nur die Peakform verändern, sondern auch die Retentionszeiten verkürzen.
- Wenn ein Säulenschaden vermutet wird, spülen Sie die Säule. Für Anweisungen zu den Spülmethoden verweisen Sie bitte auf das Benutzerhandbuch der Säule. Wenn auch nach dem Spülen keine angemessenen Ergebnisse erzielt werden können, kann die Säule manchmal zurückgespült werden. (Die Spüllösung wird in umgekehrter Richtung mit niedriger Flussrate durch die Säule, vom Ausgang der Säule, gepumpt.) Stellen Sie jedoch sicher, dass Sie das Benutzerhandbuch oder eine andere Quelle konsultieren, um zu bestätigen, dass diese Säule zurückgespült werden kann. Wenn das Spülen oder Rückspülen das Problem weiterhin nicht löst, hat die Säule das Ende ihrer Lebensdauer erreicht.
Falsche Probenlösemittel oder Injektionsvolumen
- Dies bezieht sich auf Fälle, in denen abnormale Peakformen auftreten, nachdem die Zusammensetzung des Probenlösemittels oder das Injektionsvolumen aufgrund von Vorbehandlungen oder der Konzentration der analysierten Substanz geändert wurde. In solchen Fällen sollten Sie zuerst die Peakform nach Verwendung des vorherigen Probenlösemittels und Injektionsvolumens bestätigen.
- Beispiele für die Auswirkungen der Zusammensetzung des Probenlösemittels auf die Peakform sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Chromatogramme (a) und (b) sind Ergebnisse der Verwendung des identischen Systems zur Analyse von Standardgemischlösungen, die mit zwei verschiedenen Arten von Probenlösemitteln verwendet wurden.
Obwohl bei der Betrachtung des Chromatogramms (b) allein keine Auffälligkeiten bemerkbar sind, zeigt ein Vergleich mit dem Chromatogramm (a) deutlich die Peakverbreiterung. In (a) wird dasselbe Verhältnis des organischen Lösungsmittels für das Probenlösemittel (Wasser/Acetonitril = 3/1) wie für die mobile Phase (Zitronenpufferlösung/Acetonitril = 3/1) verwendet, aber in (b) wurde nur Acetonitril, ein starkes Lösungsmittel für den Reversed-Phase-Modus, als Lösemittel verwendet. Dieses Beispiel zeigt, wie starke Lösungsmittel die Peakform beeinflussen können, wenn der Anteil im Probenlösemittel hoch wird.
Abbildung 3: Auswirkungen von Probenlösemitteln auf die Peakform
- Das Injektionsvolumen der Probe hängt mit der Verbreiterung der Probenzone in der ersten Phase der Säulentrennung zusammen. Daher kann eine Erhöhung des Injektionsvolumens zu einer Peakverbreiterung führen. Insbesondere je höher der Anteil des starken Lösungsmittels im Probenlösemittel, desto größer sind die Auswirkungen.
Totes Volumen in Fließleitungen
- Wenn Peaks sich nach der Verwendung von verschiedenen Schläuchen (aber mit demselben Innendurchmesser) verbreitern, kann dies auf totes Volumen an den Schlauchverbindungen (zwischen der Probeninjektionseinheit, der Säule und dem Detektor) zurückzuführen sein, durch die die Proben fließen. Ein Beispiel für totes Volumen ist in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 4: Totes Volumen in der Fließleitungsverbindung
- Die Länge des Schlauches, die aus dem Anschluss herausragt, variiert je nach Hersteller. Dies ist insbesondere bei den Säulenanschlüssen wichtig. Wenn neue Schläuche installiert werden, stecken Sie den Schlauch vollständig in das Gelenk und drücken Sie ihn an die gegenüberliegende Seite, während der Anschluss angezogen wird.
Temperaturgradienten innerhalb der Säulen
- Wenn beispielsweise hohe Flussraten, hohe Säulentemperaturen oder eine Säule mit großem Innendurchmesser verwendet werden und die mobile Phase durch die Säule fließt, ohne ausreichend erhitzt zu werden, kann sich in der Querschnittsrichtung der Säule ein Temperaturgradient bilden. (Die Temperatur ist in der Mitte der Säule niedriger als in der Nähe der inneren Wände.) Dies kann zu einer Peakverbreiterung führen.
- Die Auswirkungen von Temperaturgradienten können verringert werden, indem die Länge des Schlauches (Edelstahl) zwischen der Probeninjektionseinheit und der Säule verlängert wird, um die mobile Phase im Säulenofen vorzuwärmen. Dies kann jedoch auch zu einer Peakverbreiterung im Vorheizschlauch führen, was eine Optimierung des Innendurchmessers und der Länge erfordert.
Unpassende Detektor-Response-Einstellungen
- Im Allgemeinen kann das Rauschen durch Ändern der Einstellung der Detektor-Response (auch als Zeitkonstante bezeichnet) reduziert werden. Eine langsamere Response-Einstellung kann das Rauschen reduzieren, was vorteilhaft für die Hochsensitivitätsanalyse ist, führt jedoch auch zu einer Peakverbreiterung. Beispiele für die Auswirkungen der Detektionsempfindlichkeit auf die Peakform sind in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 5: Auswirkungen der Response auf die Peakform
- Abbildung 5 zeigt, dass Peaks, die früher eluieren, stärker von dieser Einstellung beeinflusst werden. Daher sollte vorsorglich die Response-Einstellung vor Beginn der Analyse überprüft werden.
