Basislinienstabilisierung bei der Verwendung von Brechungsindexdetektoren
Brechungsindexdetektoren (RID) werden häufig verwendet, beispielsweise zur Analyse von Komponenten mit geringer UV-Absorption. Allerdings benötigt es Zeit, bis sich die Basislinie stabilisiert, was zweifellos eine Quelle der Frustration für viele Benutzer*innen ist. Diese Seite behandelt das Know-how zur Basislinienstabilisierung mit einem Fokus auf nicht-wässrige Größenausschlusschromatographie (SEC), wobei hauptsächlich Tetrahydrofuran (THF) als Eluent verwendet wird.
Es kommt zu Veränderungen im Refractive Index bei ...
Anpassung der Detektortemperatur
Änderung des Brechungsindex in Reaktion auf Temperaturänderungen der Zelle
Der Brechungsindex wird erheblich von der Lösungstemperatur beeinflusst. Daher sind viele kommerziell verfügbare RIDs so konzipiert, dass sie die Temperatur um die Fließzelle kontrollieren, um sicherzustellen, dass ihre Temperatur so konstant wie möglich bleibt. Wie stark beeinflussen also kleine Variationen in der Detektortemperatur die Basislinie?
Abb. 1 zeigt ein Beispiel für Daten, die entstanden, als die Temperatur der Fließzelle von 40,0 °C auf 40,1 °C geändert wurde. Obwohl es sich nur um einen Temperaturunterschied von 0,1 °C handelt, verursacht dies deutlich Schwankungen in der Basislinie. Vermutlich geschah das aufgrund eines Unterschieds in der Heizrate zwischen der Probenfließzelle, durch die das Eluent fließt, und der Referenzzelle, in der das Eluent eingeschlossen ist.
Tatsächlich ist die Fließzelle temperaturgeregelt, sodass die Basislinie nicht so stark schwanken würde, wenn sich die Labortemperatur nur um 0,1 °C ändert. Wenn sich jedoch die Raumtemperatur plötzlich ändert oder das HVAC-System Luft auf den Detektor bläst, kann das Temperaturregelsystem im Detektor manchmal mit solchen Veränderungen nicht Schritt halten. Daher sollten Maßnahmen ergriffen werden, um die Raumtemperatur so konstant wie möglich zu halten, oder die Fließleitungen, die in den Detektor führen, mit Isolierung zu umwickeln.
Anpassung des gelösten Luftgehalts in Eluenten
Eine der Eigenschaften von RIDs ist, dass sie auch gelöste Luft in Eluenten erkennen. Daher ist es notwendig, Maßnahmen zu ergreifen, um sicherzustellen, dass der Degasierungszustand des Eluents konstant bleibt, um die Basislinie zu stabilisieren. Abb. 2 vergleicht die Größe der Basislinienstörungen bei den Ergebnissen, die mit Wasser und THF als Eluent erzielt wurden, als die Degasser-Einheit nach der Stabilisierung der Basislinie mit der abgeschalteten Degasierungseinheit eingeschaltet wurde.
Änderung des Brechungsindex, wenn die Degasierungseinheit von OFF auf ON geschaltet wird, ohne Säule, Flussrate 1,0 mL/min und DGU-20A3 Degasierungseinheit
Diese Grafik zeigt zwei Dinge.
1) Die Verringerung der gelösten Luft im Eluent erhöht den Brechungsindex.
2) Die Änderung des Brechungsindex ist für THF größer als für Wasser.
Punkt 1) zeigt den entgegengesetzten Trend zur UV-Erkennung nahe 200 nm. Bei der UV-Erkennung erhöht ein höherer Gehalt an gelöster Luft normalerweise das Absorptionsniveau.
Punkt 2) zeigt, dass im Allgemeinen je niedriger die Polarität eines Lösungsmittels ist, desto größer der Einfluss, den eine Änderung des gelösten Luftgehalts auf den Brechungsindex hat. Dies liegt daran, dass unpolare Lösungsmittel Luft leichter lösen als polare Lösungsmittel (siehe: Mechanismus der Erzeugung von Luftblasen), was zu einer größeren Änderung des Luftgehalts führt, nachdem die Entgasungseinheit eingeschaltet wurde.
Erfahrene Benutzer sowohl der wässrigen als auch der nicht-wässrigen SEC haben wahrscheinlich mehr Schwierigkeiten mit der Basislinienstabilisierung in der nicht-wässrigen SEC als in der wässrigen SEC. In der nicht-wässrigen SEC erfordert die Erkennung des Brechungsindex (oder die Erkennung der UV-Absorption nahe 200 nm) besondere Sorgfalt bei der Kontrolle des gelösten Luftgehalts.
Die in diesem Fall verwendete DGU-20A3-Degassing Unit verwendet eine Gas-Flüssigkeit-Trennmembran* mit einer höheren Luftdurchlässigkeit als frühere Modelle und Fließleitungen mit etwa 1/20 des Volumens früherer Modelle. Dies reduziert die Zeit, die erforderlich ist, um nach dem Start der Degasierung das Gleichgewicht zu erreichen, erheblich.
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Aufgrund der Materialien der Fließleitungen können einige Lösungsmittel in diesem System nicht verwendet werden, wie z. B. Hexafluorisopropanol. Wählen Sie die verwendeten Lösungsmittel im Eluenten sorgfältig aus. |
Seien Sie sich auch bewusst, dass übermäßiges Offline-Entgasen, wie bei einer Vakuum-Degassing-Unit, die einen Aspirator verwendet, dazu führen kann, dass Luft danach allmählich wieder in das Eluent redissolviert wird, sodass der sich ändernde Gehalt an gelöster Luft die Stabilisierung der Basislinie verhindert.
Anpassung der Temperatur der Eluenten
Abb. 3 zeigt die Ergebnisse aus dem Eintauchen der Eluentflasche in ein Wasserbad und die Aufzeichnung der Basislinienstörungen, während sie von 25 °C auf 35 °C erhitzt wird.
Änderung des Brechungsindex in Reaktion auf die Änderung der Temperatur der Eluentflasche ohne Säule, Eluent: THF, Flussrate: 1,0 mL/min
Selbst wenn RID und Säulenofen auf einer konstanten Temperatur gehalten werden, kann die bloße Änderung der Temperatur der Eluentenflasche dazu führen, dass die Basislinie schwankt. Ein Grund dafür ist vermutlich, dass die Menge an gelöster Luft je nach Temperatur der Flüssigkeit variiert. Je höher die Temperatur von Flüssigkeiten, desto schwieriger ist es für Luft, sich in ihnen zu lösen. Daher reduziert das Erhitzen des Eluents den Gehalt an gelöster Luft, was wiederum zu einem Anstieg des Brechungsindex führt.
Dieser Effekt kann etwas durch die Verwendung einer effizienten Degasser Unit gehemmt werden, aber wenn die Basislinie nicht stabilisiert wird, sollten Maßnahmen ergriffen werden, um nicht nur die Temperatur der Säule und des Detektors, sondern auch die Temperatur der Eluentflasche konstant zu halten. Beginnen Sie auch Analysen, nachdem die Flüssigkeiten sich an die Raumtemperatur angepasst haben, und umwickeln Sie die Eluentflasche mit Isolierung.
Verhinderung von Änderungen der Zusammensetzung in Eluenten
Da sich die Zusammensetzung von THF und Chloroform ändern kann, wenn sie über längere Zeiträume der Luft ausgesetzt sind, aufgrund von Oxidation oder anderen Faktoren, wird ein Stabilisator hinzugefügt. In vielen Fällen wird butyliertes Hydroxytoluol (BHT) als Stabilisator in Reagenzqualität THF hinzugefügt. Im Gegensatz dazu wird THF in HPLC-Qualität ohne Stabilisator verkauft und unter Stickstoffgas versiegelt, aufgrund der starken UV-Absorption von BHT und anderen Faktoren. Welches Reagenz sollten Sie also wählen?
Wenn Sie einen Detektor verwenden, bei dem die Erkennung von BHT wahrscheinlich die Messung beeinträchtigt, sollte im Allgemeinen ein Reagenz ohne den Stabilisator ausgewählt werden. Da der Stabilisator Änderungen in der THF-Zusammensetzung hemmt, ist es andererseits wahrscheinlich angemessen, das Reagenz mit Stabilisator auszuwählen, wann immer BHT nicht direkt mit den Messungen interferiert.
Dies wird in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 THF mit/ohne Stabilisator versus Detektoren
Detektoren, für die ein Reagenz mit Stabilisator verwendet werden sollte
- Brechungsindexdetektoren
Detektoren, für die ein Reagenz ohne Stabilisator verwendet werden sollte
- UV-Detektoren (insbesondere für kürzere Wellenlängen nahe 200 nm)
- Lichtstreudetektoren
- LC/MS- und LCMS/MS-Systeme
Wenn das Reagenz ohne Stabilisator verwendet wird, stellen Sie sicher, dass Sie das Datum, an dem die Reagenzflasche geöffnet wurde, aufzeichnen und sich der verstrichenen Zeit seit der Öffnung bewusst sind. Sobald das Lösungsmittel geöffnet wird, sollte es idealerweise lichtgeschützt in einem luftdichten Behälter gelagert werden, der mit Stickstoff gefüllt ist. Wenn eine Reihe von Analysen über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden, sollte die Eluentflasche wahrscheinlich leicht unter Stickstoffdruck gehalten werden, selbst während der Analysen. (Für weitere Details wenden Sie sich an den Reagenzhersteller.) Anstatt mehr THF zu kaufen, als benötigt wird, empfehlen wir, kleinere Mengen häufiger zu kaufen, auch wenn dies etwas teurer ist.
Darüber hinaus können bei feuchtem Wetter Basislinienstörungen, die durch die Absorption von Feuchtigkeit verursacht werden, durch die Installation eines Entfeuchtungsschlauches, der mit Kieselgel gefüllt ist, im Öffnungsbereich der Eluentflasche gehemmt werden. (Gt)
