Spülmethoden für ODS-Säulen

Eine ODS-Säule ist mit einer Füllung aus Octadecylsilyl-Gruppen (ODS-Gruppen oder C18-Gruppen) gefüllt, die chemisch an einen Kieselgelträger gebunden sind. ODS-Säulen werden für die Umkehrphasen-Chromatographie verwendet. Aufgrund ihrer hohen theoretischen Bodenzahl und schnellen Gleichgewichtseinstellung sind ODS-Säulen für eine breite Palette von Anwendungen geeignet. Ihre geringen Kosten machen sie zu den am häufigsten verwendeten Säulen für die HPLC.

Bei der Verwendung dieser Säulen können jedoch einige Probleme auftreten. Typische Ursachen und Symptome werden im Folgenden vorgestellt. Die nachfolgenden Erklärungen behandeln die Spülmethoden, um die adsorbierten Komponenten zu entfernen.

(1) Oberfläche der ODS-Säulenfüllung (stationäre Phase)

Bei der Überlegung zur Spülmethode ist es wichtig, die Adsorptionskräfte zu berücksichtigen, die auf die Komponenten wirken. Zuerst werden wir überprüfen, was wir über die Oberfläche der ODS-Füllung wissen.

Hydroxylgruppen sind ursprünglich in einer Si-OH-Struktur an der Oberfläche des Kieselgelträgers angebracht. Dies wird als "Silanol" bezeichnet. ODS-Füllungen entstehen durch die Bindung von ODS-Gruppen an das Silanol durch chemische Reaktionen. Da die ODS-Gruppe jedoch voluminös und nicht hochreaktiv ist, bleibt viel nicht aktiviertes Silanol übrig.

Da dieses verbleibende Silanol während der Analyse eine Vielzahl von nachteiligen Effekten haben kann*, wird das Silanol durch Reaktionen mit Trimethylsilyl-(TMS-)Gruppen, die nicht voluminös (sehr reaktiv) sind, abgedeckt. Dieser Vorgang ist als "end capping", "Trimethylsilylierung" oder "sekundäre Silylierung" bekannt. Es wird jedoch immer noch eine kleine Menge Silanol auf der Oberfläche verbleiben, und die ODS-Gruppen können allmählich entfernt werden, sodass Silanol während der Analyse in der ODS-Säule entsteht.

(2) Spülen von Komponenten, die durch hydrophobe Wechselwirkung zurückgehalten werden

Der Begriff "hydrophobe Wechselwirkung" weist auf eine Affinität zwischen Bereich mit niedriger Polarität und einer ODS-Gruppe mit niedriger Polarität hin. Es ist die Rückhaltkraft, die in der echten Umkehrphasen-Chromatographie verwendet wird. Bereiche mit niedriger Polarität umfassen Alkylgruppen und aromatische Ringe. Oben im Diagramm auf der rechten Seite wird eine Propylgruppe der Komponente von einer ODS-Gruppe angezogen.
Eine mobile Phase mit niedriger Polarität wird verwendet, um Komponenten zu spülen, die durch diese Kraft zurückgehalten werden. Wenn beispielsweise eine 1/1 Methanol/Wasser-Lösung als mobile Phase für die Analyse verwendet wird, senkt das Erhöhen des Methanolverhältnisses auf 3/1 die Polarität der Spüllösung und erleichtert das Abspülen von Komponenten mit einer hohen Retentionskraft, die in der Säule verbleiben.
Die Kompatibilität muss berücksichtigt werden, wenn die mobile Phase geändert wird. Wenn in dem obigen Beispiel anstelle von Wasser eine Pufferlösung verwendet wird, können Salze ausfällen, wenn das Verhältnis des organischen Lösungsmittels plötzlich erhöht wird. Wenn eine Mischung aus Pufferlösung und organischem Lösungsmittel als mobile Phase für die Analyse verwendet wird, muss die Säule und die Flusslinie zuerst mit einer Wasser/organischen Lösungsmittel-Mischung * im gleichen Verhältnis gespült werden, bevor das Verhältnis des organischen Lösungsmittels erhöht wird.
Überwachen Sie während des Spülens mit dem Detektor, um festzustellen, ob die Basislinie stabilisiert ist.

(3) Spülen von Komponenten, die durch Wasserstoffbrückenbindung oder ionische Bindung adsorbiert sind

Wie oben in (1) besprochen, bleibt eine kleine Menge Silanol auf der Fülloberfläche zurück. Der Wasserstoff im Silanol zieht Elektronen zum Sauerstoff, wodurch eine etwas positive statische elektrische Ladung entsteht. Daher hat der Wasserstoff die Eigenschaft, eine Wasserstoffbrücke mit dem einsamen Elektronenpaar (etwas negative statische Ladung) am Stickstoff in der Komponente zu bilden. (Mittelreihe des oben rechts abgebildeten Diagramms) In einer leicht sauren oder neutralen mobilen Phase adsorbiert diese Wasserstoffbrückenbindung basische Komponenten und verursacht Tailings. (Silanol bildet bei höherem pH ionische Bindungen.) Stark adsorbierte basische Komponenten können nicht durch organische Lösungsmittel abgespült werden.
In diesem Fall muss eine saure Spüllösung verwendet werden, um die Wasserstoffbrückenbindung einzuschränken, indem ein Wasserstoffion mit dem einsamen Paar am Stickstoff koordiniert wird (Protonierung).
R-NH₂ → R-NH₃⁺
Stellen Sie eine saure Spüllösung her, indem Sie etwa 0.1 % Phosphorsäure oder Essigsäure hinzufügen.

Im Allgemeinen werden die Komponenten, die stark in der Säule zurückgehalten werden, als solche basischen Komponenten angesehen. Dies ist ein Grund, warum die Zugabe von Säure für das Spülen in (2) oben vorteilhaft ist. Spülen Sie nicht mit Wasser, wenn basische Komponenten in der Säule verbleiben (einschließlich, wenn basische Verbindungen als Ionenaustauschreagenz verwendet werden). Das Spülen mit Wasser erhöht den pH-Wert um die adsorbierten Komponenten, was das Kieselgel leicht löslich macht. Die Zugabe von Säure hilft, dieses Problem zu vermeiden.

Einige Komponenten sind jedoch schwierig zu entfernen, einfach indem die mobile Phase sauer gemacht wird. Dies ist der Fall bei Kationen mit einem großen Ionenradius, wie Tetrabutylammonium.

In diesem Fall wird angenommen, dass ionische Bindungen mit der negativen Ladung des dissoziierten Silanols auftreten. (Oben im Diagramm)
Ionische Bindungen werden stärker, je größer der Ionenradius ist. Das folgende Diagramm zeigt den Fall, in dem eine terminale Aminogruppe unter sauren Bedingungen positiv geladen ist. Aufgrund der hohen Ladungsdichte treten mehrere Hydrationsstufen auf, was es schwierig macht, dass Anionen sich nähern. Da die Hydration jedoch schwach ist für Ammoniumionen, die von voluminösen Alkylgruppen umgeben sind, können sich Anionen leichter nähern.

Referenz: Während der Austauschchromatographie beginnt die Ionen-Elution mit Ionen mit kleinem Radius: F^-, Cl^- und Br^-. Dies zeigt an, dass ionische Bindungen stärker werden, je größer der Ionenradius ist.

Um die ionischen Bindungen zu schwächen, verwenden Sie eine saure Spüllösung, die große Radius-Anionen* als Ionenaustauschpaare enthält. Die Säure suppressiert die Dissoziation von Silanol.
* Zum Beispiel, fügen Sie etwa 0.1 M Natriumperchlorat hinzu. Obwohl Natriumperchlorat ein anorganisches Salz ist, hat es die Eigenschaften, in 100 % Methanol oder Acetonitril zu lösen und nicht leicht auszukristallisieren. Da die Perchlorationen leicht Ionenaustauschpaare in der mobilen Phase bilden, kann es auch für die Ionenaustauschchromatographie verwendet werden. (Dies ist jedoch ein gefährliches Reagenz. Erwärmen Sie es nicht und bringen Sie es nicht in die Nähe einer offenen Flamme. Verdünnen Sie die Abfallflüssigkeit auf einen neutralen Zustand und entsorgen Sie sie über einen lizenzierten Abfallentsorgungsdienstleister.)

Ergänzung

Wenn Silanol dissoziiert, trägt es eine negative Ladung. Wenn es an Metallionen gebunden ist, fördert es die Adsorption von Koordinationsverbindungen und sauren Verbindungen. Um Metallionen abzuspülen, wird eine konkurrierende ionisches Spezies oder ein Metallmaskierungsmittel zur Spüllösung hinzugefügt. Außerdem ist es wünschenswert, die Dissoziation von Silanol einzuschränken, daher ist es effektiv, den pH-Wert der mobilen Phase / Spüllösung zu senken.

Darüber hinaus schwächt die Ansäuerung der Lösung die Koordination von Koordinationsverbindungen und schränkt die Dissoziation der Carboxylgruppe in sauren Verbindungen ein. Da Kieselgel jedoch um pH 4 am stabilsten ist, ist die Verwendung von extrem sauren Lösungen über einen langen Zeitraum untersagt. Idealerweise verwenden Sie eine kleine Menge Phosphorsäure oder Essigsäure.

(4) Zusammenfassung

Wir haben oben beschrieben, dass das häufigste Verfahren zur Verwendung einer Mischung aus organischem Lösungsmittel und Pufferlösung als mobile Phase wie folgt ist: 1) Spülen mit einer Mischung aus organischem Lösungsmittel und saurem Wasser im gleichen Mischungsverhältnis, 2) Spülen mit einer sauren Spüllösung mit einem erhöhten Anteil an organischem Lösungsmittel, 3) wenn die Einschluss von stark basischen Verbindungen zu erwarten ist, Natriumperchlorat zur Lösung hinzufügen.

Die optimale Spülmethode variiert jedoch je nach Analyse. Bei der Bestimmung der Methode sollten Sie stets beachten, was die Probe enthält und welche mobile Phase verwendet wird.
Die Nutzungseinschränkungen können unterschiedlich sein, selbst wenn ODS-Säulen den gleichen Kieselgelträger verwenden. Lesen Sie sorgfältig das Benutzerhandbuch Ihrer Säule.