Auswirkungen von Probenlösemitteln auf die Peakform

Die vom Autosampler injizierte Probe gelangt über die Schläuche zur Trennsäule. Wenn die Mischung aus Probenlösemittel und mobiler Phase unzureichend ist, bevor das Probenlösemittel die Säule erreicht, kann die Peakform je nach Art des Probenlösemittels schlechter werden. Die Peakform kann verbreitert werden, wenn ein Probenlösemittel mit höherer Elutionsstärke als die mobile Phase verwendet wird. Darüber hinaus kann die Verwendung des UHPLC-Systems, das Schläuche mit kleinerem Innendurchmesser verwendet, bei unpassendem Mischen des Probenlösemittels und der mobilen Phase betroffen sein.

Abb. 1 zeigt den Einfluss der Elutionsstärke des Probenlösemittels auf die Peakform, wobei die theoretische Bodenzahl während der Koffein-Analyse durch Reversed-Phase-Chromatographie als Beispiel dient. Das Parameter der Peakform wird durch die theoretische Bodenzahl (TPN) dargestellt, die die Schärfe des Peaks angibt. In diesem Fall wird die Mischung aus Methanol/Wasser (3:7) als mobile Phase verwendet. Beim Vergleich der TPNs unter Verwendung von Methanol als Probenlösemittel, das eine höhere Elutionsstärke als die mobile Phase hat, und Wasser, das eine niedrigere hat, ist ein Unterschied in den TPNs zu erkennen. Wenn das Injektionsvolumen weiter erhöht wird, ist ein bemerkenswerter Unterschied zu sehen. Abb. 2 zeigt einen Vergleich zwischen Injektionsvolumen und Peakform, wenn Methanol als Probenlösemittel verwendet wird. Die Probenkonzentration wird so angepasst, dass die absolute Injektionsmenge gleich bleibt. Es ist zu erkennen, dass die Peakform sich verschlechtert, wenn das Injektionsvolumen steigt.

Abb. 3 beschreibt ein Bild der Analytika und der Probenlösemittel, die durch die Säule fließen. Das Probenlösemittel kann als Teil der mobilen Phase in der Säule betrachtet werden, aber die Verwendung eines Probenlösemittels mit höherer Elutionsstärke kann die Analytika schneller bewegen, als wäre es eine mobile Phase. Im Gegensatz dazu konzentriert sich bei der Verwendung eines Probenlösemittels mit niedrigerer Elutionsstärke das Analyt zunächst, bevor es erneut beginnt, sich in der mobilen Phase zu trennen, da das Probenlösemittel als mobile Phase mit niedrigerer Elutionsstärke fungiert. Die Verwendung eines Probenlösemittels mit einer Elutionsstärke, die niedriger ist als die der mobilen Phase, kann die Peakform schärfen, da die Diffusion des Analyt in der Säule unterdrückt werden kann.

Abb. 3　Vergleich der Retention unter Verwendung von 2 Arten von Probenlösemitteln mit unterschiedlicher Elutionsstärke
 

Wie oben erwähnt, wird erklärt, dass der Unterschied in der Elutionsstärke zwischen dem Probenlösemittel und der mobilen Phase die Peakform beeinflusst. Sie kann geschärft werden, indem ein Probenlösemittel mit einer niedrigeren Elutionsstärke als die mobile Phase verwendet wird. Wenn die Probe jedoch mit einem Lösungsmittel mit höherer Elutionsstärke (z. B. 100 % Methanol in der RP-LC) vorbereitet wird, besteht die Sorge über den Aufwand zusätzlicher Vorbehandlungen wie Substitution und Verdünnung.

Abb. 4　Bild des Injektionsprozesses

Autosampler in der Nexera-Serie (LC-40-Serie) und i-Serie sind standardmäßig mit einer Vielzahl automatischer Vorbehandlungsfunktionen wie der Co-Injektionsfunktion ausgestattet. Abb. 4 beschreibt den Betriebsablauf im Co-Injektionsmodus. Die Verwendung dieses Modus ermöglicht es, das Lösungsmittel für die Co-Injektion automatisch aus einem bestimmten Fläschchen zu aspirieren und zusammen mit der Probe in die analytische Säule zu injizieren. Daher kann ein scharfer Peak ohne den Aufwand des manuellen Austauschs oder der Verdünnung erhalten werden. Abb. 5 zeigt einen Vergleich von Chromatogrammen mit und ohne Co-Injektion des Verdünnungsmittels (Wasser) bei Proben, die mit einem Lösungsmittel vorbereitet wurden, das eine höhere Elutionsstärke als die mobile Phase in der Umkehrphasen-Analyse aufweist. Dieser Vergleich ist das Ergebnis einer Analyse, bei der das Injektionsvolumen des Verdünnungsmittels schrittweise erhöht wurde. Die mit Co-Injektion erhaltenen Chromatogramme zeigen, dass ein erhöhtes Injektionsvolumen nicht zur Peakform beiträgt, was in allen Analysen zu scharfen Peaks führt.
 

Abb. 5　Vergleich der Peakform bei Co-Injektion des Verdünnungsmittels
 

Bei der Analyse von Rückständen von Pestiziden und tiermedizinischen Arzneimitteln kann das organische Lösungsmittel, 100 % Methanol, in der Vorbereitung auf die Festphasenextraktion durch das Probenlösemittel ersetzt werden. Insbesondere wenn die Analyten stark polare Verbindungen in der Rückphasen-Chromatographie sind, führt eine Kombination aus einem hohen Wasseranteil als mobiler Phase und einem Probenlösemittel mit höherer Elutionsstärke dazu, dass sich die Peakform verschlechtert. Die Co-Injektion mit der automatischen Vorbehandlungsfunktion ermöglicht eine Analyse, die quantitative Zuverlässigkeit garantiert und eine gute Peakform erzielt. 
 

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