Veränderung der Peakform - Teil 2
6 - Veränderung der Peakform Teil 1
7 - Veränderung der Peakform Teil 2
8 - Peakflächenfluktuationen
9 - Retentionszeit Teil 1
10 - Retentionszeit Teil 2
11 - Säulenlebensdauer - Teil 1
12 - Säulenlebensdauer - Teil 2
13 - Detektor
14 - Flusslinienleckage
15 - Zusammenfassung
Im zweiten Teil der Veränderungen der Peakform werden die möglichen Ursachen für verschiedene Effekte erläutert. Dabei sind die am häufigsten vorkommenden das Tailing und die Peakverbreiterung.
1. Fronting
Als Fronting wird allgemein eine Asymmetrie des Peaks bezeichnet, bei der ein Peak am Ende steiler ist als am Anfang. Nimmt das Fronting langsam zu, ist in den meisten Fällen eine defekte Säule die Ursache. Durch die normale Alterung oder den Betrieb der Säule außerhalb der Spezifikationen kann die Phase Schaden nehmen. In diesem Fall hilft nur der Tausch der Säule und die Anpassung der chromatographischen Gegebenheiten.
Aber auch eine Säulenüberladung führt zu Fronting der Peaks. Wird zu viel Probe aufgegeben, sind alle aktiven Stellen am Säulenkopf belegt und die noch nachfolgende Probe fließt mit weniger Interaktion an den besetzten Stellen vorbei. Sind Sie an hohen Injektionsvolumina gebunden, kann eine Säule mit einem größeren Innendurchmesser oder höherer Kapazität Abhilfe schaffen.
Ein weiterer Grund kann ein inkompatibles Probenlösungsmittel mit der mobilen Phase sein. In diesem Fall hilft nur die Änderung des Probenlösungsmittels. Eine zu niedrige Temperatur der Säule kann ebenso Fronting verursachen.
2. Tailing
Das Tailing ist neben der Verbreiterung die häufigste Peakformveränderung und genau das Gegenteil des Frontings. Die ansteigende Flanke des Peaks besitzt eine größere Steigung als das Ende.
Wird eine Standard RP-Phase verwendet, kann die Interaktion von basischen Analyten mit den freien Silanolgruppen zu einen Tailing führen. Tauschen Sie in diesem Fall die Säule durch eine Polymersäule oder eine mit guten Endcapping. Einige Säulenhersteller bieten extra Säulen für die Analyse von stark basischen Substanzen an.
Eine schadhafte Säule oder falsche Analysenbedingungen, wie z.B. ein falscher pH-Wert der mobilen Phase können ebenso, wie beim Fronting auch zu einem Tailing führen.
Ein sehr häufiger Grund ist das Totvolumen des Systems. Dies wirkt sich bei kleinen Retentionszeiten stärker aus als bei größeren. Überprüfen Sie alle Anschlüsse, sodass Sie keine zusätzlichen Totvolumina, z.B. zwischen Säulenkopf und Kapillare einbauen. Aber auch die richtige Wahl der Kapillaren ist entscheidend. Im folgenden Bild sehen Sie den Einfluss von zwei verschiedenen Kapillaren zwischen Säule und Detektor. Allerdings sollten Sie auch beachten, dass engere Kapillaren höhere Rückdrücke im System erzeugen können. Passen Sie daher die Dimensionen der Kapillaren an ihr chromatographisches System an, so dass Sie nicht an die Grenzen der zulässigen Druckmaxima stoßen
3. Peakverbreiterung
Im vorherigen Teil der Veränderung der Peakform wurden bereits die Detektoreinstellungen angesprochen. So kann ein zu hoher Detektorresponse zu einer Peakverbreiterung führen. Aber auch die normale Alterung der Säule kann zu einer Verbreiterung führen.
Kommt es zu einer Peakverbreiterung durch Dispersion im Injektionsventil, empfiehlt sich die sogenannte Sandwich Injektion mit kleinen Luftblasen. Kapillaren mit einem zu großen Durchmesser oder ein Totvolumen durch falsch angezogene Verbindungen können ebenso zu Dispersion und folglich zu Peakverbreiterungen führen.
Bei isokratischen Messungen kommt es aufgrund der longitudinalen Diffusion innerhalb der Säule zwangsläufig zur Verbreiterung der Peaks und ist demnach nicht zu verhindern. Dies betrifft vor allem später eluierende Peaks. Hier hilft nur der Wechsel zu einer Gradientenmethode.
Wie so oft spielt auch die Temperatur eine Rolle. Temperaturgradienten innerhalb der Säule sind zwingend zu vermeiden da Sie eine Verbreiterung begünstigen. Daher sollte immer ein Säulenofen verwendet werden und die mobile Phase vorgeheizt werden. Erfolgt keine Vorheizung kommt es auch bei einer temperierten Säule zu einem Temperaturgradienten. Wie im folgenden Bild zu sehen ist, kann dies ebenso zu einer Peakverbreiterung führen.
Dinge, die täglich zu beachten sind:
Säule:
- Spezifikationen der Säule einhalten
- Stöße vermeiden – Rissbildung!
- Extreme pH-Werte vermeiden
- Temperieren!
- Für die Analyse geeignete Säule wählen
System:
- Totvolumen klein halten
- Verbindungen korrekt anziehen
- Mobile Phase vorwärmen
Wie in den letzten zwei Teilen angesprochen, sind die Gründe für eine Peakverbreiterung vielfältig und nicht pauschal zu beantworten. Hier empfiehlt sich das systematische Vorgehen und der Vergleich mit einem Referenzsystem. Stetig fortschreitende Veränderungen sprechen für die Säule als Schuldigen, plötzlich auftretende eher für eine Änderung der chromatographischen Gegebenheiten oder Probleme der Hardware.
Ihr Shimadzu Deutschland LC-Team