Theorie der Massenspektrometrie - Teil 2
1 - Theorie der Massenspektrometrie - Teil 1
2 - Theorie der Massenspektrometrie - Teil 2
3 - Troubleshooting: Was mache ich bei hohem Hintergrundrauschen?
4 - Troubleshooting: Welche Möglichkeiten habe ich bei Sensitivitätsverlust?
5 - Methodenoptimierung: Quellenoptimierung
6 - Methodenoptimierung: MRM-Optimierung
Datenaufnahmearten bei Quadrupol MS-Systemen
Für unterschiedlichste Fragestellungen stehen in der fortschrittlichen Massenspektrometrie verschiedene Möglichkeiten zur Datenaufnahme zur Verfügung. Diese Aufnahmearten unterscheiden sich je nach technischem Aufbau des verwendeten MS-Systems. Ein LC-MS-Single Quadrupol Massenspektrometer ermöglicht beispielsweise neben der Auswahl der Polarität, die Durchführung zweier Aufnahmearten: Den Scan Modus und das Selected Ion Monitoring (SIM).
Scan
Im Scanmodus werden sowohl Gleich- als auch Wechselspannungen über die Stäbe eines Quadrupols sequenziell über eine Rampe angepasst, so dass sukzessive ein spezifischer definierter Massenbereich erfasst wird. Dadurch passieren pro definierter Zeiteinheit nur Ionen den Quadrupol, deren Masse zu Ladungsverhältnisse (m/z-Werte) innerhalb eines bestimmten Spannungsfensters einen stabilen Flugweg durch den Quadrupol besitzen. Solche Ionen erreichen den Detektor und ergeben hier ein entsprechendes Signal. Am Ende einer Spannungsrampe wird der Quadrupol in diesem Aufnahmemodus in den Spannungsmodus zurückversetzt, der zu Beginn der Rampe angelegt wurde. Die hierfür benötige Zeit nennt sich Interscan-Delay oder Pause Time. Im Scan Modus werden auf diese Weise nach und nach viele Spektren aufgenommen, die anschließend in Form eines Chromatogramms den Verlauf einer chromatographischen Trennung beschreiben können.
Single Ion Monitoring (SIM)
Während eines SIM werden nur bestimmte ausgewählte Ionen mit voreingestellten m/z-Werten durch den Quadrupol geleitet. Hierfür werden die für eine stabile Flugbahn durch den Quadrupol nötigen Gleich- und Wechselspannung nicht in einer Rampe verändert, sondern für die einzeln gewählten m/z Verhältnisse als fixe Werte angelegt. Diese festen Werte werden nach und nach eingestellt und kontinuierlich abgearbeitet. Auch hierbei wird die Zeit für den Wechsel auf die jeweils folgenden Spannungswerte als Interscan-Delay oder als Pause Time bezeichnet. Man unterscheidet bei beiden Aufnahmemodi also zunächst grundsätzlich die Spannungseinstellzeit und die Aufnahmezeit (Passagezeit). Während ein Scan Modus aber vergleichsweise viel Zeit für die Ausführung einer Spannungsrampe benötigt, kann im SIM Modus wesentlich mehr Aufnahmezeit für die einzelnen (wenigen) selektierten m/z-Werte verwendet werden. Daneben werden im SIM Modus eventuell störende Signale anderer m/z-Verhältnisse nicht aufgenommen und das Rauschen demzufolge verringert. Die Verringerung des Grundrauschens und die längere Datenaufnahmezeit pro Analyt ergeben zusammen im SIM Modus eine üblicherweise höhere Sensitivität im Vergleich zum Scan Modus. Allerdings ist das Spektrum dementsprechend nur aus den ausgewählten m/z-Verhältnissen zusammengesetzt und die Informationen nicht ausgewählter Massen gehen verloren. Zur Quantifizierung wird also häufig der SIM Modus eingesetzt, wobei bei schnelleren Systemen durchaus auch eine Kombination von SIM und Scan verwendet werden kann, um innerhalb eines Messlaufes sowohl qualitative auch auch quantitative Ergebnisse erhalten
Die Verwendung komplexerer Triple-Quadrupol MS-Systeme ermöglichen weitere Datenaufnahmearten. Der Grund liegt hier vor allem in der Verwendung einer Kollisionszelle (ebenfalls als zweiter Quadrupol, oder Q2 bezeichnet). Diese Kollisionszelle ist zwischen dem Quadrupol 1 und Quadrupol 3 geschaltet.
Die Verwendung komplexerer TripleDieser Aufbau eröffnet die Möglichkeit für eine selektivere, spezifische Analyse und die Quantifizierung definierter Strukturen bis hin zu strukturellen Fragestellungen zu artverwandten Verbindungen oder gleichen Abgangsgruppen. Dabei gibt es grundsätzlich eine Vielzahl an Fragmentierungsmöglichkeiten. Wir beschränken uns zur Erläuterung hierbei auf die CID – Collision Induced Dissociation, welche typischerweise für Triple-Quad LC-MS Systeme Verwendung findet. Abbildung 13 zeigt schematisch eine Molekülfragmentierung in der Kollisionszelle durch CID. Die Kollisionszelle ist mit einem Stoßgas gefüllt, bei Shimadzu Systemen kommt hierbei Argon zum Einsatz. Durch eine angelegte Spannung (Kollisionsenergie) werden die in die Kollisionszelle geleiteten Moleküle/Ionen gegen die Gasmoleküle gestoßen und so in einzelne Fragmente gebrochen.
Bezüglich ihrer Selektivität und ihrer hohen Sensitivität sind Triple-Quad MS-Systeme das Mittel der Wahl bei der quantitativen Analyse von Substanzen im regulierten Umfeld. Hierzu zählt beispielsweise die Bestimmung von Schadstoffen in Lebensmitteln und Umwelt, oder auch die Untersuchung von physiologischen Parametern beim therapeutischen Medikamentenmonitoring im klinischen Bereich.
Im Folgenden sind die typischen Scanmodi eines Triple Quadrupol Massenspektrometers dargestellt, die bei verschiedensten Fragestellungen zum Einsatz kommen.
Produkt-Ionen Scan
Während eines Produkt-Ionen Scans dient der erste Quadrupol Q1 als Filter, so dass hier durch die eingestellte Gleich- und Wechselspannung gezielt nur ein bestimmter m/z-Wert bzw. Precursor (oder Mutterion) den Quadrupol passieren kann (SIM Modus). Dieser Precursor wird im nächsten Schritt in dem zweiten Quadrupol Q2, der Kollisionszelle, fragmentiert. Zum Abschluss nutzt der Q3 eine Spannungsrampe, um einen definierten Massenbereich für die Datenaufnahme zu nutzen (Scan) und so die entstehenden Fragment-Ionen zu analysieren.
Precursor-Ionen Scan
Der Precursor-Ionen Scan läuft gegenteilig des Produkt-Ionen Scans. Statt der gesetzten Auswahl eines Precursors im ersten Quadrupol, wird in diesem Fall der m/z-Wert des gesuchten Produkt-Ions in Q3 festgelegt und der Scan findet in Q1 statt.
Neutral Loss Scan
Bei der Verwendung des Scanmodus Neutral Loss Scan ist sowohl der Q1 als auch der Q3 für den Scan eingestellt, allerdings laufen die Spannungsrampen um einen definierten m/z Wert versetzt zueinander. So können Precursor-Ionen bestimmt werden, die einen bestimmten Neutralverlust in der Kollisionszelle unterliegen wie bspw. einer Phosphatgruppe.
Selected Reaction Monitoring (SRM)
Wie in der Abbildung zu erkennen, dient sowohl der Q1 als auch der Q2 als Massenfilter (SIM Modus). So wird nur gezielt eine Precursormasse für die Fragmentierung gewählt bzw. isoliert und ebenfalls nur ein spezifisches Fragment aufgenommen. Die Aufnahmen einer höheren Anzahl von SRM bzw. spezifischen Fragmentionen im Q3 wird als Multiple Reaction Monitoring (MRM) bezeichnet. Die Verwendung des MRM Modus ist die gängiste Art der Datenaufnahme bei Triple-Quadrupol Geräten. Die Selektivität einer solchen Analyse ist hierbei enorm und auch die Sensitivität der Methode sehr hoch, da die zwei Quadrupole (Q1 und Q2) im SIM Modus arbeiten und spezifische Fragmente auslesen. Selbst die relativen Anteile dieser gewählten Fragmente sind innerhalb einer Messmethode spezifisch. Bei der MRM Aufnahme werden üblicherweise mindestens zwei Fragmente für jeden Precursor aufgenommen (sogenannte Übergänge). Je nach Fragestellung kann diese Anzahl für bestimmte Fragestellungen auf eine höhere Anzahl an Übergängen eingestellt werden.