Welche Möglichkeiten habe ich bei Sensitivitätsverlust?

Sinkende Empfindlichkeit des Analyten

Schritt 1:
Liegt ein Problem am Gerät vor oder ist die Probe selbst das Problem?

Schritt 2:

Eine weitere wichtige Frage, die wir uns stellen sollten, lautet: Was hat seit der letzten „guten“ Messung stattgefunden? 
Häufig sind es nur Kleinigkeiten, die zu Verlusten in der Empfindlichkeit führen. Zu kontrollieren sind folgende Punkte:

Probenvorbereitung:

Hier spielen viele verschiedene Faktoren eine große Rolle, wodurch die Fehleranfälligkeit immens steigt.

•    Wurde ein anderes Vorbereitungsprotokoll verwendet? 
Oft können schon kleinste Änderungen große Verluste der Intensitäten bewirken.

•    In welchem Zustand befindet sich das Labormaterial? 
Zum Beispiel können hier nicht kalibrierte Pipetten oder Feinwaagen zu einer hohen Fehlerquote führen.

•    Haben sich Lieferanten oder Qualität der verwendeten Lösemittel und Chemikalien geändert?
In der Vergangenheit hat sich immer wieder gezeigt, dass es große Unterschiede in Qualität der Lösemittel und Chemikalien gibt. So kann auch durch eine fehlerhafte Charge einer Substanz im Workflow der Probenvorbereitung die ganze Analytik unbrauchbar werden. Die Lösemittel sind dabei nicht nur in der Vorbereitung von hoher Wichtigkeit, sondern ebenfalls sind sie bedeutend bei der LC-MS Analytik selbst. So sollten immer möglichst reine (LC-MS grade) Lösemittel verwendet werden. 
Verwendung von Reinstwasseranlage: Viele solcher Analgen liefern Wasser in ausreichender Güte für die LC-MS Analytik. Allerdings ist die Qualität stark von dem Wartungszustand oder dem Alter des jeweiligen Systems abhängig. Bedenken Sie zudem, dass etliche Lösungsmittel für die LC-MS nur bedingt bzw. komplett ungeeignet sind und sich zum Teil erst nach längerer Verwendung negativ auswirken.

•    Wie ist die Stabilität der Probe?
Eine Vielzahl an Substanzen bauen sich im Laufe der Zeit ab. So verringert sich von einer Messung zur nächsten Messung die Konzentration des Analyten und es resultieren geringere Intensitäten während der massenspektrometrischen Analyse. Wichtig ist hier die richtige Lagerung der Probensubstanzen; zum Beispiel bei Temperatur und UV-Empfindlichkeit kühl und dunkel aufbewahren.

Verwendete Materialien/Consumables: 

Auch Änderungen in der Güte von Verbrauchsmaterialien können zu Einbußen der Analytsignale führen (einschließlich möglicher Fehler in verschiedenen Chargen). 

Trennsäule: Wie lange ist die Säule bereits im Einsatz? Säulen haben eine gewisse Lebensdauer. Die Überschreitung einer solchen Lebensdauer kann zu Empfindlichkeitsproblemen oder auch den Eintrag von Kontaminationen in das MS-System führen. Wurde eine neue Säule verwendet? Besitzt diese das gleiche Säulenmaterial? Wenn es hier Unterschiede zu der vorherigen Säule gibt, können auch negative Einflüsse innerhalb der Messung entstehen.

Tipp: Dokumentieren Sie die Nutzung der Chromatographie-Säule in einem Laborbuch.

Probenvials: Trotz kleiner vermeidlich unbedeutender Vials, finden sich ebenfalls hier bei plötzlichen Änderungen der Consumables Probleme. Je nach Beschichtung der Glaswände innerhalb des Vials, können sich dort einige Substanzen festsetzen und so nicht über der Autosampler aufgenommen werden, um in das MS zu gelangen. Auf die Verwendung von Kunststoffgefäßen sollte generell, wenn möglich, verzichtet werden. Diese können neben Weichmachern oder andere Polymerbestandteile eine Reihe von Substanzen in die Probe eintragen, die sich im späteren Verlauf negativ auswirken.

Veränderungen am MS-System: 

•    Wurde die richtige Messmethode zur Analyse genutzt? 
Durch Bedienung des Systems durch mehrere Anwender*innen, durch verschiedene Applikationen oder während einer Methodenoptimierung kann es zu einer Verwechslung der MS-Methode kommen. So verwendet die Methode in der Messung möglicherweise andere Quellenparameter, Aufnahmeraten oder „falsche“ MRM-Übergänge etc., wodurch Moleküle schwächer oder sogar gar nicht ionisieren bzw. sich massenspektrometrisch messen lassen.

Überlegen Sie sich hier eine für Sie ideale Ordnerstruktur, damit Sie den Überblick der Methoden behalten, um schnell und einfach die richtige Methode für Ihre Messung zu wählen.

•    Haben kürzlich Wartungen oder Ereignisse von außen stattgefunden?

 

Um Ereignisse jeglicher Art nachzuvollziehen ist der Tipp, ein Tagebuch für das jeweilige System zu führen. In diesem können alle durchgeführten Wartungen oder Ähnliches aufgenommen werden (Was? Wer? Wann?). 
Bei plötzlichen Einbrüchen der Sensitivität nach Wartungsarbeiten, bspw. einer Reinigung, liegt es nahe, dass der Fehler durch einen solchen Vorgang entstanden ist. Mit der Hilfe einer solchen Dokumentation lässt sich das Problem weiter eingrenzen. 

Weitere mögliche Ursachen

 

1. Ionensuppression 

Ionensuppression bedeutet, es werden nicht genügend Ladungsträger für das jeweilige Molekül bereitgestellt. Gründe für dieses Phänomen können sein: 
 

•    Co-eluierende Substanzen oder weitere Matrixbestandteile
•    Ungeeignete Laufmittel
•    Additive in den Laufmitteln (bspw. Ionenpaarreagenzien – sollten generell vermieden werden)
•    Nicht flüchtige Substanzen   

Da diese Effekte großen Einfluss auf die Ionisierung haben, muss die Möglichkeit einer Ionensuppression geprüft werden. Zur Kontrolle nehmen Sie zunächst einen Scan auf. Grundsätzlich ist die vollständige Aufnahme eines breiten Massenfensters bei der Fehlersuche empfehlenswert. Dargestellt hier am Beispiel eines Triple Quadrupol MS:

In dem Fall ist es optimal sowohl einen Scan im Q1 als auch im Q3 durchzuführen – bei negativer und positiver Polarität. Dadurch erhalten wir relativ schnell und einfach viele Informationen in nur einem Messlauf. Innerhalb der resultierenden Massenspektren kann daraufhin nach eventuellen Störmassen gesucht werden.

Diese Massen können dann durch Recherche (Internet, Massentabellen) ermittelt und bestimmten Substanzen zugeordnet werden.

Beispiel: Triethylamin 

1. Q1- als auch Q3-Scan bei Geschwindigkeit von 1000 u/s; ESI; positive und negative Polarität.

2. Abgleich mit Tabelle und der aufgeführten m/z-Werte

2. Kontamination/Verschmutzung oder falsche Justierung

 

Auch können Verschmutzungen zu Verlusten der Signaltintesitäten führen. Die Reinigung wurde im vorherigen Kapitel bereits ausführlich beschrieben. 
Neben solchen Kontaminationen kann ebenfalls eine falsche Justierung, bspw. der ESI-Quelle, zur Verringerung der Sensitivität führen. Achten Sie hier auf die richtige Stellung der ESI-Pipe und den optimierten Abstand Ihrer Ionenquelle zum Ioneneinlass.

Justierung der ESI-Pipe am Beispiel der Quelle des LCMS-2020 Single-Quad MS:

Achten Sie hier darauf, dass das Ende die Kapillare 0,5 bis 1 mm aus dem Spitze der Quelle hinausragt.

3. Auto-Tuning

In der Regel ist die Massengenauigkeit von Quadrupol-Systemen über einen langen Zeitraum von mehreren Monaten ausreichend stabil. Dennoch empfiehlt es sich mindestens einmal im Jahr ein Tuning durchzuführen. Im Falle eines „falschen“ oder „verschobenen“ Tunings kommt es ebenfalls zu Einbußen der Empfindlichkeiten am MS-System.

Vorgang des Tunings an Shimadzu Quadrupol MS-Systemen: 

Tipp: Zum Tuning werden immer höher konzentrierte Standards verwendet. Achten Sie bitte darauf, Kapillaren und weitere Verbindungen vor und nach einen Tuningvorgang zu spülen. Dadurch vermeiden Sie Verstopfungen oder Kontaminationen, die ein Tuningerfolg verhindern. Daneben ist beim Tuning auch darauf zu achten, dass eine verwendete Tuninglösung frisch oder innerhalb eines angegebenen Haltbarkeitsdatum verwendet wird.

Ablauf des Tunings: 

1. Anschluss des Tuning Mixes Die fertige Tuning-Lösung wird in die vorgesehen Glasflasche am Gerät gegeben und mit einer Kapillare mit der ESI-Quelle verbunden. Der Quellenabstand (ESI-Sprayer - Eingang in das MS) wird auf +1 gesetzt. 

2. Tuning wählen Anschließend wählen Sie über die Software LabSolutions die Option „Tuning“.  

3. Tuning Starten Drücken Sie Start Tuning. Das Tuning läuft vollständig automatisiert. Die Einbringung der Tuning Lösung funktioniert über einen zugeführten Gasdruck in die Glasflasche. 

4. Tuning-Report prüfen Final erhalten Sie ein Tuningfile, das Sie gegen eine Vorlage gegenprüfen können.  

5. Tuning speichern Speichern Sie den Tuningfile, wenn alle Werte innerhalb der Grenzwerte liegen und übernehmen Sie es als Default. Ihr Gerät ist nun wieder frisch getunt.

Zusammenfassung

Bei sinkenden Intensitäten von Analytsignalen sind folgende Hinweise zu beachten:

•    Verwenden Sie frische Lösemittel (LC-MS grade)
•    Nutzen Sie zur Probenvorbereitung saubere Labormaterialien
•    Lagerungsbedingungen des Probenmaterials einhalten
•    Behalten Sie den Überblick Ihrer Methoden und dokumentieren Sie die Arbeiten an Ihrem LC-MS System, um plötzliche auftretende Probleme rückverfolgen zu können
•    Überprüfen Sie mögliche Ionensuppressionen 
•    Achten Sie auf richtige Einstellungen in Hard- und Software wie bspw. die Justierung der ESI-Kapillare oder Quellenparameter
•    Kontrollieren Sie Ihr MS-Tuning