Methodenoptimierung: Quellenoptimierung

Die Analyten in jeder Probe verhalten sich auch im Hinblick auf eine jeweilig unterschiedliche Matrix bezüglich ihres Ionisierungsverhaltens unterschiedlich. Neben verschiedenen Lösemitteladditiven spielen zahlreiche physikalische Parameter eine entscheidende Rolle. Hierzu gehören bspw. Flussraten, Temperatureinstellungen, Gasflüsse oder Spannungen in der Ionenquelle.  

Zur Ermittlung der optimalen Einstellungen gibt es die Option eine Vielzahl an Methoden zu erstellen, um die jeweilig optimalen Parameter für eine Messserie zu ermitteln. Hierbei kann man bspw. die Quellentemperatur in definierten Schritten erhöhen. Anschließend lässt sich eine Sequenz oder ein Probenbatch generieren, der bspw. über Nacht die so erstellen Methoden abarbeitet. Dabei empfiehlt es sich möglichst nur einen Optimierungsschritt (oder wenige Optimierungsschritte) auf einmal durchzuführen, um positive und auch negative Auswirkungen einer Parametereinstellung nachzuvollziehen. Am folgenden Tag können die Ergebnisse ausgewertet und so das ideale Setup bestimmt und abgespeichert werden. 

Alternativ gibt es die (häufig bevorzugte – wesentliche schnellere) Option der Online- Quellenoptimierung. Hierbei wird am laufenden System innerhalb einer Messung mehrfach injiziert und online ein jeweiliger Parameter verändert. Durch die Online-Optimierung lassen sich sehr schnell Einstellungen erkennen, die zu einer Verbesserung der Messergebnisse beitragen können. 

Wir möchten Ihnen dieses anhand eines Shimadzu-Systems im nachstehenden Beispiel demonstrieren:

 

1. Entfernen Sie den Autosampler aus der Systemkonfiguration:

Wählen Sie dafür zunächst „System Configuration“ und markieren Sie den Autosampler auf der rechten Seite des Fensters. Anschließend wird durch Drücken des roten Pfeils der Autosampler aus der aktuellen Konfiguration genommen. Bestätigen Sie mit „OK“. Dadurch wird der Autosampler manuell steuerbar.

2. Erstellen Sie die Mess-Sequenz und MS-Methode:

Programmierung der Sequenz am Modul des Samplers: 

Drücken Sie

 

Mittels der Zahlentasten können Sie die Parameter anpassen. Bestätigen Sie jeweils mit „enter“. Stellen Sie die Sequenz wie folgt ein:

Wir injizieren hierbei also jede halbe Minute 1 µl aus Rack 1, Probenvial 1 in 30facher Wiederholung. 

Das Injektionsvolumen ist hier abhängig von der Analytkonzentration zu setzen. Die Laufzeit sollte zwischen 0,5 und 1 min betragen. Auf dieser Weise wird eine schnelle Optimierung realisiert und das System hat ausreichend Zeit die wiederholten Injektionen durchzuführen.  

Durch die Taste „CE“ speichern Sie den Sample Table.

Programmierung der Messmethode am Massenspektrometer: 

Die Methodeneinstellungen sollten den Parametern der Messmethode entsprechen. Lediglich folgende Einstellungen sollten für diesen Optimierungsschritt angepasst werden: 

„LC-Stop Time“ und „MS Acquisiton Time“: 60 -120 min
HPLC-Pump: „Isocratic Flow“ und einem organischen Lösemittelanteil zwischen 70 und 90 %, 300 – 400 µl/min 

Die so neu erstellte Methode speichern Sie ab. Und denken Sie daran für diesen Optimierungsvorgang die HPLC-Säule auszubauen oder zu umgehen. Stellen Sie nun die zu optimierende Probe auf die passende Vialposition im Autosampler. Damit sind alle Vorbereitungen für die Quellenoptimierung fertig gestellt.

 

3. Messen und Parameter verstellen

Im nächsten Schritt kann mit der soeben neu erstellten Methode ein „Single Run“ gestartet werden. Da wir den Sampler aus der Konfiguration genommen haben, ist es in dem Fall nicht nötig im MS Fenster die Vialposition oder das Injektionsvolumen anzugeben. Alle nötigen Informationen werden aus der erstellten Sample List von dem Modul übernommen. Nachdem die Methode über die Software gestartet wurde, aktivieren Sie nun auch die wiederholte Injektion am Autosampler durch Betätigen des Startbuttons. 

Während des Messlaufes können Sie die zu optimierenden Signal im „Chromatgram View“ beobachten und gleichzeitig Schritt für Schritt die einzelnen Quellenparameter manuell verstellen. Betrachten Sie hier besonders die Signale der kritischen Analyten.  

Häufig verwendete optimierte Parameter bei der Methodenentwicklung:

Tipp: Beobachten Sie das Verhalten des Signals jeweils 2 oder 3 Injektionen nach der Parameteränderung. Je nach Umstellung wird eine kurze Equilibrierungszeit in der Quelle benötigt; so erhalten Sie zuverlässige Aussagen bezüglich der Veränderungen in den Parametern. 
Wie erwähnt, gehen Sie hier Parameter für Parameter vor, um die optimalen Bedingungen zu erhalten.  Beispiel: Sie verringern die Temperatur der Desolvation Line von 250 °C auf 200 °C. Die Signalintensität, der zu untersuchenden Masse verringert sich in den folgenden zwei Injektionen. Daher erhöhen Sie wieder die Temperatur auf 250 °C und versuchen es nun mit einer Temperaturerhöhung, bspw.um 25 °C. Das Signal steigt eventuell im Folgenden deutlich an. Möglicherweise ist hier bereits das Maximum. Falls bei 300 °C das Signal nun wieder schwächer wird, markieren Sie sich die 275 °C als „Bestwert“.  So gehen Sie alle Quellenparameter sukzessive durch. Wenn Sie alle Werte getestet haben, können Sie die so ermittelten „Bestwerte“ in die Methode übernehmen und final abspeichern. 

Bei einer Multikomponentenanalyse und einer Vielzahl an Analyten konzentrieren wir uns auf die „schwierigsten“ oder „kritischsten“ Substanzen. So kann es vorkommen, dass nach einer solchen Quellenoptimierung vorher starke Signale geschwächt werden, dagegen aber vorher sehr schwache Signale um einen wesentlichen Faktor gesteigert werden. In einem solchen Fall hängt es von der Fragestellung ab, welche Analyten die höchste Wichtigkeit für die Messung haben und Sie müssen sich für einen Kompromiss entscheiden, welche Einstellung für diese Applikation am besten passt. 

Hinweis: Der Datenfile kann wie gewohnt über den Postrun der LabSolutions LCMS Software geöffnet werden. Über die Funktion View -> Status of Data Acquisition können viele der verschiedenen Parameter noch einmal kontrolliert werden.

Quellenoptimierung mit der LC 40 HPLC-Serie 

Der Weg der Quellenoptimierung verläuft hier entsprechend. Aber es können durch erweiterte Pretreatment-Programme des Autosamplers die Injektionen für die Quellenoptimerung bequem über die „Stack Injection“ (wiederholte Injektion) programmiert werden. Im Falle dieser Anlage kann der Autosampler also in der Systemkonfiguration belassen werden, da sich alle nötigen Einstellungen bei diesem Modell in der Software vornehmen lassen. 

Öffnen Sie hierfür das Fenster zur Wahl der Optionen für das Pretreatment Programm unter dem Reiter des Autosamplers: