Retentionszeitschwankungen - Teil 1
6 - Veränderung der Peakform Teil 1
7 - Veränderung der Peakform Teil 2
9 - Retentionszeit Teil 1
10 - Retentionszeit Teil 2
11 - Säulenlebensdauer - Teil 1
12 - Säulenlebensdauer - Teil 2
13 - Detektor
14 - Flusslinienleckage
15 - Zusammenfassung
Die in der HPLC gängigsten Detektionsarten sind die UV/VIS-Absorption, Fluoreszenz- und Brechungsindex-Detektion. Diese optischen Detektionsarten sind teils stoffspezifisch für Substanzen mit Choromphoren oder Fluorophoren, aber auch nicht selektiv bei Verwendung des Brechnungsindexes. Die Zuordnung der Analyten erfolgt in den meisten Fällen über die Retentionszeit. Schwankt die Retentionszeit kann es zu Fehlbefunden kommen. Daher ist die Reproduzierbarkeit der Retentionszeit von großer Bedeutung.
Im Folgenden sowie in der kommenden Kurseinheit werden die verschiedenen Einflüsse dargestellt.
1. Einfluss der Temperatur
Wie bei vielen Problemen in der HPLC hat auch die Temperatur Einfluss auf die Retentionszeit. Je höher die Temperatur, desto geringer ist die Viskosität der mobilen Phase. Daher sinkt auch der Gegendruck im System bei steigender Temperatur. Als Faustregel gilt, dass eine Änderung der Temperatur um 1°C eine Verschiebung der Retentionszeit von 1 bis 2% zur Folge hat. Daher ist der zeitliche Shift durch Temperaturschwankungen bei spät eluierenden Analyten größer. Im Folgenden wurden vier Parabene bei verschiedenen Temperaturen gemessen.
Vergleicht man die Messung bei 20°C und 50°C, so kommt es fast zur Halbierung der Gesamtlaufzeit. Dieser Einfluss kann natürlich auch zur Optimierung oder Verkürzung der Methode verwendet werden, sofern sie in den Spezifikationen der Säule bleiben. Bei sehr hohen Temperaturen ist aber mit einer verminderten Lebensdauer der meisten Säulen zu rechnen.
Soll die Temperatur zur Optimierung verwendet werden, dann ist zu beachten, dass nicht alle Analyten gleich auf eine Temperaturänderung reagieren. Wie im Beispiel rechts gezeigt, können sie sich ganz unterschiedlich verhalten. Während bei 20 °C die Analyten getrennt sind, coeluieren Sorbinsäure und Benzoesäure bei 30 °C. Wird die Temperatur weiter erhöht, kann es sogar zu einem Tausch der Elutionsreihenfolge kommen. Wenn dies nicht bemerkt wird, kann es auch hier zu Fehlbefunden kommen.
Im besten Fall verwenden Sie einen Säulenofen, um die Temperatur Ihrer Säule so konstant wie möglich zu halten.
1: Sorbinsäure, 2: Benzoesäure, 3: Methylparaben
2. Veränderung der Flussrate
Jede Pumpe besitzt eine gewisse Anzahl an Verbrauchsteilen, welche in regelmäßigen Abständen ausgetauscht werden sollten. So sind z.B. die meisten Kolbendichtungen für die Förderung eines gewissen Volumens spezifiziert. Ist der Verschleiß zu stark fortgeschritten, können sie undicht werden und somit die Flussrate beeinflussen. Schwanken die Retentionszeiten, so kann demnach auch eine defekte Pumpe das Problem sein.
Um die Pumpen zu überprüfen ist der einfachste Weg diese auszulitern. Nehmen Sie hierzu einen Messzylinder, schließen Sie eine Gegendruckkapillare direkt an die Pumpe an und stellen Sie einen definierten Fluss ein. Vergleichen Sie nun die Zeit, in der ein gewisses Volumen gefördert wird mit der eingestellten Flussrate.
Überprüfen Sie die Verbrauchsmaterialien Ihrer HPLC in regelmäßigen Abständen. Halten Sie ebenso Ersatzteile bereit um defekte Teile schnell auszutauschen.
Alle Maßnahmen, welche zur Stabilisierung der chromatographischen Bedingungen führen, helfen leider nur wenig, wenn Sie mit sehr unrobusten Methoden arbeiten. Unter solchen Bedingungen haben bereits kleine Änderungen z.B. der Temperatur oder des Eluenten einen großen Einfluss auf die Retentionszeit.
Folglich müssen häufig Proben wiederholt werden oder die Auswertung händisch nachgearbeitet werden. Dies ist vor allem im regulierten Umfeld ein großes Problem. Investieren Sie daher lieber mehr Zeit in die Entwicklung robuster Methoden. Sie werden im Nachhinein weniger Aufwand und mehr Zeit in der Routine haben und die vorher investierte Zeit wird sich sehr schnell ausgleichen.
Dinge, die täglich zu beachten sind:
Allgemein:
- Regelmäßige Eignungstests durchführen
- Überprüfung der Verbrauchmaterialien in regelmäßigen Abständen
- Dokumentation von Retentionszeiten, Auflösung, etc. der Referenzlösungen
System:
- Säulenofen zur Temperierung verwenden
- Säulentagebuch führen
- Wartungen dokumentieren
Die kommende Kurseinheit hat neben den Einflüssen der Eluentenzusammensetzung, der Säule und der Equilibrierungszeit ebenfalls die Retentionszeitschwankungen als Thema.
Ihr Shimadzu Deutschland LC-Team