Methodenoptimierung: MRM-Optimierung
5 - Methodenoptimierung: Quellenoptimierung
6 - Methodenoptimierung: MRM-Optimierung
MRM-Optimierung
Für die Aufnahme im MRM-Modus haben Spannungswerte der Quadrupole und Kollisionsenergien zur Fragmentierung einen großen Einfluss auf die Sensitivität und Selektivität. So werden bei der MRM-Optimierung genau diese elektrische Spannungswerte und Kollisionsenergien, die bei der Aufnahme eine Rolle spielen, angepasst – speziell auf das jeweilige Massenspektrometer.
Hierzu gibt es automatisierte Tools innerhalb der Software LabSolutions LCMS (Optimization for Method). Innerhalb dieses Tools stehen drei verschiedene Optionen zur Verfügung:
• MRM-Optimierung inklusive Precursor Suche
• MRM-Optimierung bei automatischer Ermittlung der Produkt-Ionen
• Anpassungen der Spannungsparameter und Kollisionsenergien bei bekannten MRM-Werten
Vorbereitung:
Der zu untersuchender Analyt sollte im Idealfall als Einzelstandard oder als wenig komplexes Standardgemisch vorliegen. Für die MRM-Optimierung empfiehlt es sich einen etwas höher konzentrierten Standard zu verwenden, auch wenn die späteren Messungen um ein Vielfaches sensitiver sein werden. Als praktikabel haben sich hierbei häufig Standardkonzentrationen im Bereich von 50-100 ng/µl erwiesen (abhängig von Substanz/Probe). Sollten die Signale hierbei zu hoch sein, können verwendete Standardproben nach dem ersten Versuch weiter verdünnt werden.
Erstellen Sie vor der eigentlichen MRM-Optimierung zunächst Ihre Analysemethode. Dazu nehmen Sie jeweils einen Scan in beiden Polaritäten (positiv und negativ) auf und bewerten das Spektrum abhängig des Signals der Masse Ihres Analyten. Zudem kann auf diesem Weg eine mögliche Adduktbildung Ihres Zielanalyten ermittelt werden. Gerade im Bezug zur Untersuchung nach Adduktbildungen empfiehlt es sich einen Scan sowohl im Q1 als auch Q3 zu programmieren:
Beginnen Sie mit den Standarad Quellenparametern, falls das ideale Setup noch nicht bekannt ist. Wählen Sie einen isokratischen Pumpenfluss von 200 – 400 µl/min mit einem 50 – 80 % Anteil der organischen Phase (abhängig vom Analyten) und verwenden Sie zunächst keine Trennsäule. Für die Messzeit können Sie 1 min wählen, um diesen Optimierungsschritt zu beschleunigen.
Die sich anschließende MRM-Optimierung ist im Folgenden am Beispiel eines einfachen Pestizidmixes dargestellt. Hierbei gehen wir davon aus, dass bereits sowohl die m/z-Werte der Precursor sowie der Fragmente bekannt sind:
Öffnen Sie in der LabSolutions LCMS Ihre zu optimierende Messmethode, in der Ihre MRM-Parameter eingetragen sind.
Im nächsten Schritt öffnen Sie das „Optimization for Method“ Tool und wählen Sie den Punkt „Optimize Voltage“.
Markieren Sie im folgenden Fenster die drei Optionen: Adjust Precursor m/z, Optimize Voltage und Adjust Product m/z.
Öffnen Sie die Advanced Settings und wählen Sie zu Beginn die Default Settings (s. Abbildung unten) durch das Anhaken der jeweiligen Zeilen aus. Diese Werte beschreiben die Grenzwerte und Schrittweiten der eingesetzten Spannungsparameter für die Optimierung.
Zum Abschluss legen Sie den Speicherort fest. Zudem haben Sie die Auswahl zwischen „Apply to method file“ und „Create new method files by every event“.
Apply to method file:
Die optimierten Spannungswerte werden direkt in die Methode übertragen.
Create new method files by every event:
Für jeden Optimierungsschritt wird eine neues Methodenfile erstellt. So haben Sie die Möglichkeit im Nachgang die Schritte zu verfolgen und nochmals manuell zu überprüfen.
Schritt 1: Precursor Adjustment
Während dieses Schrittes wird zunächst nach dem zu optimierenden m/z-Wert gesucht. Anschließend ermittelt das Tool automatisiert das intensivste Signal der Precursormasse und passt dementsprechend den m/z-Wert in der verwendeten Methode an.
Schritt 2: Optimize Voltage (CE)
Nach dem Precursor Adjustment werden die Kollisionenergien für jedes Produkt-Ion bzw. jeden MRM-Übergang angepasst. In dem hier gezeigten Beispiel werden die Kollisionsenergien von -15 kV bis -50 kV in einer Schrittweite von 5 kV geprüft.
Schritt 3: Optimize Voltage detail (CE)
Folgend der ersten CE Optimierung erfolgt eine weitere Optimierung in einem schmaleren Bereich mit kleineren Schrittweiten, um so noch genauer den idealen Wert der Kollisionsenergie zu erhalten. Der so ermittelte Wert wird anschließend in der Messemethode übernommen.
Schritt 4: Product Adjustment
Dieser Punkt ist vergleichbar mit Schritt 1 – dem Precursor Adjustment, nur werden in diesem Fall die m/z-Werte der jeweiligen Produkt-Ionen noch einmal fein nachjustiert.
Schritt 5/6: Optimize Voltage Q1 Pre-Bias und Q3 Pre-Bias
Während der letzten beiden Schritte innerhalb der automatisierten MRM-Optimierung werden die Spannungsparameter zum Eintritt der Quadrupole 1 und 3 eingestellt. Der Ablauf hier ist identisch wie zuvor - verschiedene Spannungen werden überprüft und die Einstellung mit bester Signalintensität wird für die Methode übernommen.
Methodenparameter übernehmen:
Nach der Optimierung erhalten Sie eine Textdatei, in der Sie die bestimmten Werte einsehen können. Falls Sie vorab die Option „Create new method files by every event“ gewählt haben, können Sie zusätzlich die einzelnen Optimierungsschritte überprüfen.
Wenn Sie mit der MRM-Optimierung zufrieden sind, können Sie die neuen Werte übernehmen.
Zusätzliche Optimierungsschritte
Die Sensitivität Ihrer Analytik ist, neben der Konzentration Ihre Zielanalyten, häufig abhängig von der Lösemittelzusammensetzung (dem Gradienten) bzw. von verwendeten Additiven. Die Empfindlichkeit positiv ionisierender Analyten lässt sich so bspw. durch einen Säurezusatz im LM steigern. Bestimmte Analyten neigen bei Zusatz von Salzen in Abhängigkeit bestimmter Parameter zu Adduktbildung. Diese kann unerwünscht sein, wenn der gewählte Precursor methodenbedingt feststeht und eingehalten werden muss. Eine Adduktbildung kann aber bei einer variablen MRM-Methode auch von Vorteil sein, etwa wenn die beobachteten Addukte eine erhöhte Empfindlichkeit aufweisen.
Tipp: Basische Komponenten ionisieren in der Regel besser in positiver Polarität. Mit der Zugabe von sauren Komponenten kann dieser Effekt noch weiter verbessert werden; Beipsiel:
Dagegen ionosieren saure Komponenten besser im negativen Messmodus. In diesem Fall kann die Zugabe basicher Komponenten bei der Ionisierung der Analyten helfen.
Neben den erwähnten Optimierungsmöglichkeiten gibt es auch eine Vielzahl an weiteren Optionen zur Verbesserung der Analytik an der HPLC. Shimadzu bietet hier bspw. ein speziell dafür angepasstes System in Kombination mit intuitiver Software – das Method Scouting System.
Das Method-Scouting System hilft Ihnen dabei, die ideale Säule – Lösemittelkombination zu ermitteln.
Screenshot der Software Method Scouting Solution:
Mit Hilfe dieser Software lässt sich bequem die optimale Säule-Lösemittelkombination ermitteln.