In der letzten Woche wurden bereits der Einfluss der Temperatur und schwankende Flussraten auf die Retentionszeit behandelt. Diese Woche schauen wir auf den Einfluss der Eluenten auf die Retentionszeit. Verändert sich die Zusammensetzung oder Dichte, kommt es schnell zu Retentionszeitschwankungen.

 

1. Inadäquate Re-Equilibrierung im Gradienten

Vor jeder Messung ist darauf zu achten, dass sich die Säule im Gleichgewicht befindet. Wird zwischen zwei verschiedenen mobilen Phasen gewechselt, wie es z.B. beim Ersetzen der Lagerungslösung geschieht, muss die Säule mit ausreichend Säulenvolumina equilibriert werden. Aber auch bei Gradientenmethoden zwischen den Messungen. Typischer Weise besitzen die Messmethoden am Ende einen Spülschritt mit hohem Anteil Organik. Diesem muss im Nachgang zwingend ein ausreichend langer Equilibrierungsschritt folgen, welcher den Anfangsbedingungen der Methode entspricht.

Ist die Equilibrierung zu kurz, kann es zu Retentionszeitschwankungen oder wie im obigen Beispiel gezeigt von Messung zu Messung zu immer kürzer werdenden Retentionszeiten kommen. In diesem Fall befindet sich die Säule nicht mehr im Gleichgewicht.

2. Veränderung der Eluentenzusammensetzung

Ein großes Augenmerk sollte auf die mobile Phase gelegt werden. Zusammen mit der Säule sind die Eluenten maßgeblich für die Trennung und für stabile Messungen verantwortlich. Bewahren Sie daher Ihre Eluenten in geeigneten Vorratsflaschen auf und verschließen Sie diese mit geeigneten dichtschließenden Deckeln. Lassen Sie die Eluenten nicht in der Sonne oder im direkten Zug einer Klimaanlage stehen.

Je nach Zusammensetzung des Eluenten kann schnell ein gewisser Teil an organischem Lösungsmittel verdampfen und die Zusammensetzung des Eluenten ändert sich. Den Einfluss einer nicht verschlossenen Eluentenflasche wurde mit einem Gemisch von Wasser und Acetonitril getestet. Je mehr Acetonitril verdampft, desto geringer wird die Elutionskraft und die Retentionszeiten werden länger.

3. Herstellung der Eluenten

 

Die Sorgfalt im Umgang mit den Eluenten sollte bereits mit der Herstellung anfangen. Hierfür sollten Sie genaue Vorschriften ausarbeiten, um eine immer gleiche Qualität der Eluenten zu gewährleisten. Ein gutes Beispiel ist die Herstellung einer 50% Lösung von Methanol in Wasser. Diese Lösung kann auf verschiedene Weise hergestellt werden, und je nachdem, welcher Mitarbeiter sie herstellt, kann es zu unterschiedlichen Ergebnissen kommen.

  • Wasser/Methanol = 1/1 (v/v)
  • Messen Sie 500 ml Wasser und 500 ml Methanol getrennt ab und mischen Sie sie zusammen
  • Man erhält nicht 1 L, sondern 0,94 L
 

  • 50% (v/v) Methanol Wasser Lösung
  • Geben Sie 500 ml Methanol in einen 1L Messkolben und Wasser bis zu 1 L hinzu
  • Höherer Anteil an Wasser
 

Im ersten Fall werden 500 ml Wasser mit 500 ml Methanol gemischt. Das Ergebnis sind 0,94 L einer 1/1 Lösung in Bezug auf das Volumen. Im zweiten Fall werden 500 ml Methanol in einem 1 L Messkolben vorgelegt und mit Wasser auf 1 L aufgefüllt. In diesem Fall erhält man 1 L einer 50% Methanol Lösung bezogen auf das Volumen.

Diese beiden Lösungen besitzen unterschiedliche Elutionskräfte, was an dem folgenden Beispiel mit einem Phosphatpuffer und Acetonitril sichtbar wird. Die Retentionszeiten der einzelnen Analyten schwankt stark und kann im schlechtesten Fall aus dem Identifikationszeitfenster fallen.

 

Neben den hier aufgeführten Gründen gibt es noch eine Vielzahl weiterer Gründe die Retentionszeitschwankungen hervorrufen können. Dies können z.B. eine nicht ausreichende Pufferkapazität, eine schlechte Onlinemischung, eine defekte oder ausgetrocknete Säule oder sich ansammelnde Kontaminationen sein.

Haben Sie mit schwankenden Retentionszeiten zu tun, empfiehlt sich als erstes die Temperierung der Säule zu überprüfen und im Nachgang die Pumpe sowie die Eluenten zu überprüfen. Tauschen Sie für einen schnellen Test die Eluenten durch neue aus und überprüfen die Retentionszeiten mit ihren Referenzen.

 

Dinge, die täglich zu beachten sind:

Anfällige Bedingungen:

  • Reversed-Phase Eluent ist 100% Wasser
  • Extrem saure oder alkalische Eluenten in Silicasäulen
 Zusätzliche Equilibrierungszeit bei:
  • Normalphasen-Chromatographie
  • Reverse Phase Chromatographie mit Ionenpaar-Reagenzien

Allgemein:

  • Säulentagebuch führen
  • Wartungen dokumentieren
  • Vorschriften für die Herstellung von Eluenten erstellen
  • Vorratsflaschen verschlossen und sicher lagern
  • Auf eine ausreichende Equilibrierungszeit achten

Die kommenden zwei Kurseinheiten haben die Trennsäule und Ihre Lebensdauer als Thema.

Ihr Shimadzu Deutschland LC-Team