In der modernen instrumentellen Analytik ist die Massenspektrometrie nicht mehr wegzudenken. Durch dieses Analyseverfahren können sowohl qualitative als auch quantitative Bestimmungen verschiedener Atom- oder Molekülmassen durchgeführt werden. Dabei finden sich die unterschiedlichsten Einsatzmöglichkeiten, wie beispielsweise die Überprüfung der Reinheit von Pharmazeutika oder Qualitäts- und Synthesekontrollen in chemischen Prozessen.

Beispiel einer LC-MS Analytik von 38 Aminosäuren innerhalb von 9 Minuten

Aber welche Vorteile bietet die analytische Erweiterung mittels Massenspektrometrie?

Hochsensitive Erfassung von Analyten
Zusätzliche Selektivitätsmerkmale bspw. durch Informationen von der Molekülgröße
Analyse unbekannter Verbindungen (Fragmentierung, Bibliotheken, Summenformelbestimmung)
Messung chromatographisch überlappender Verbindungen
Schnelle Detektion mit vielen Datenpunkten(ideal auch für schnelle Chromatographie, Multikomponentenanalytik und Hochdurchsatz)

Aufbau eines Single-Quadrupol Massenspektrometers

Ein Massenspektrometer ist im Allgemeinen folgendermaßen aufgebaut:

1. Eine Ionenquelle dient der Ionisierung und zur Überführung der Analyten in die Gasphase.

2. Der Analysator (hier der Quadrupol) ist das Herzstück des Massenspektrometers, um die Ionen nach ihrem Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) zu separieren.

3. Der Detektor erfasst die auftreffenden Ionen, verstärkt die Signale und gibt die Informationen schließlich an eine Datenstation (PC) zur Aufzeichnung und Auswertung weiter.

Ionenquelle

Es stehen eine Vielzahl an Ionisierungs-Technologien zur Verfügung. Die Auswahl der Ionenquelle ist abhängig von dem zu untersuchenden Probenmaterial und der jeweiligen Fragestellung. Dabei spielen viele Parameter, vor allem der Polaritätsbereich, die Molekülgröße der Analyten und die Komplexität des Probenmaterials eine wichtige Rolle. Insbesondere in der Flüssigchromatographie gekoppelten Massenspektrometrie (LC-MS) findet man die ESI (Electrospray Ionization) und die APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) als Ionisierungs-Technologien wieder.

Übersicht der gängigen Ionisierungstechniken und der Applikationsbereiche

ESI – Electrospray Ionization:

Bei dem Ionisierungsverfahren der Electrospray Ionization wird ein sehr feiner Nebel von der eingebrachten Probenlösung (durch das Chromatographiesystem oder einer Spritzenpumpe) an der Spitze der ESI-Kapillare erzeugt. Für die Ionisierung der Analyten wird an dieser ESI-Kapillare eine hohe elektrische Spannung im Bereich ± 3 bis 5 kV angelegt. Diese sorgt zunächst für eine Akkumulation von Ladungen auf der Tröpfchenoberfläche des Flüssigkeitssprays. Daneben wird zur Unterstützung der Lösemittelverdampfung ein sogenanntes Nebulizing Gas und häufig ein zusätzliches Heizgas verwendet, welches parallel neben der ESI-Kapillare bzw. des ESI-Sprays in die Quelle eingeleitet wird. Aufgrund der dadurch herbeigeführten Lösemittelverdampfung kommt es zu einer Oberflächenverkleinerung mit einhergehender Verdichtung der akkumulierten Ladungen und letztlich zur Übertragung von Ladungen auf die einzelnen Analyten. Dieser Vorgang wiederholt sich mehrfach und es entstehen somit immer kleinere Tröpfchen, die in die Gasphase übergehen - bis schließlich nur die einzelnen Ionen übrigbleiben.

Prozess der Electrospray Ionization

APCI – Atmospheric Pressure Chemical Ionization:

Hauptsächlich kommt die APCI-Quelle und die hier verwendete chemische Ionisierung bei der Analytik von wenig oder mittel-polare Analyten zum Einsatz. In der APCI Quelle werden Lösemittel und Probenlösung durch sehr hohe Temperaturen und Hilfsgase wie Stickstoff (Nebulizer Gas) in die Gasphase überführt. Mittels der Corona-Nadel und der hier anliegenden Hochspannung werden zunächst überwiegend die Gas- und Lösemittel-Moleküle ionisiert. Die Ladungen werden anschließend in mehreren teils radikalischen Reaktionsschritten auf die Moleküle der Analyten übertragen. Im Unterschied zur ESI entstehen bei der APCI aufgrund der größeren Distanz einzelner Moleküle im Gasgemisch überwiegend einfach geladene Ionen.

Prozess der Atmospheric Pressure Chemical Ionization

Dual-Quellen:

Neben den ESI- und APCI-Quellen stehen auch Quellen zu Verfügung, die diese beiden Technologien kombinieren. Eine solche DUIS-Quelle kommt in dem LCMS-2050 Single Quadrupol zum Einsatz. Das macht die Einsatzmöglichkeiten dieses Single Quadrupol MS sehr flexibel.

Aufbau der DUIS-Quelle

Ein Quadrupol besteht, wie der Name bereits verrät, aus vier parallel angeordneten zylindrischen Metallstäben. Am Quadrupol werden sowohl eine Gleichspannung in Flugrichtung der Ionen als auch eine hochfrequente Wechselspannung oder Radiofrequenz zwischen den Quadrupolstäben angelegt. Dabei ist die Polarität der Wechselspannung bei den jeweilig gegenüberliegenden Quadrupol-Stäben im Wechsel identisch. Je nach Abstimmung von Gleich- und Wechselspannung im Quadrupol können Ionen definierter m/z-Werte den Quadrupol passieren oder werden aufgrund von unstabilen Resonanzen aussortiert. Ob sich die Ionen in dem Feld des Quadrupols stabil verhalten oder nicht, wird durch die Mathieu-Gleichung beschrieben:

Wie in der Abbildung zu sehen, können die Ionen innerhalb einer stabilen Oszillation den Quadrupol passieren. Jedoch für Ionen mit anderen m/z-Werten sorgen die so eingestellten Spannungswerte des Quadrupols für ein unstabiles Feld bzw. eine unstabile Flugbahn. Dadurch werden diese Ionen „herausgefiltert“ und können den Detektor nicht erreichen. Durch eine schnelle Änderung der Quadrupol-Spannungen im Millisekunden-Bereich können viele Spannungen nacheinander geschaltet oder die Spannung als Spannungsrampe angelegt werden. Dadurch kann der Analysator bestimmte voreingestellte Ionen selektiv filtern oder gewählte Massenbereiche analysieren.

Detektoren

Für gewöhnlich werden Sekundärelektronenvervielfacher oder Microchannel Plates (MCP) als Detektoren in der Massenspektrometrie eingesetzt. Die Ionen treffen bei einem Sekundärelektronenvervielfacher zunächst auf die sogenannte Konversionsdynode. Aus dieser werden durch den Aufschlag Elektronen freigesetzt, die anschließend im Electron Multiplier vervielfacht werden. Dadurch werden die Ionensignale entsprechend verstärkt und können letztlich auf dem Computer bzw. in der entsprechenden Software als Signal ausgegeben werden.

Schema eines MS-Detektors. Hier dargestellt ist Sekundärelektronenvervielfacher

Datenaufnahmearten bei Single Quadrupol MS-Systemen

Für unterschiedlichste Fragestellungen stehen in der fortschrittlichen Massenspektrometrie verschiedene Möglichkeiten zur Datenaufnahme zur Verfügung. Diese Aufnahmearten unterscheiden sich je nach technischem Aufbau des verwendeten MS-Systems. Ein LC-MS Single Quadrupol Massenspektrometer ermöglicht beispielsweise neben der Auswahl der Polarität, die Durchführung zweier Aufnahmearten: Den Scan-Modus und das Selected Ion Monitoring (SIM).

Scan:

Im Scan-Modus werden sowohl Gleich- als auch Wechselspannungen über die Stäbe eines Quadrupols sequenziell über eine Rampe angepasst, so dass sukzessive ein spezifischer definierter Massenbereich erfasst wird. Dadurch passieren pro definierte Zeiteinheiten nur Ionen den Quadrupol, deren Masse-zu-Ladung-Verhältnisse (m/z Werte) innerhalb eines bestimmten Spannungsfensters einen stabilen Flugweg durch den Quadrupol besitzen. Solche Ionen erreichen den Detektor und ergeben hier ein entsprechendes Signal. Am Ende einer Spannungsrampe wird der Quadrupol in diesem Aufnahmemodus in den Spannungsmodus zurückversetzt, der zu Beginn der Rampe angelegt wurde. Die hierfür benötige Zeit nennt sich Interscan-Delay-Zeit. Im Scan-Modus werden auf diese Weise nach und nach viele Spektren aufgenommen, die anschließend beispielsweise den Verlauf einer chromatographischen Trennung beschreiben können.

SIM (Single Ion Mointoring):

Während eines SIM werden nur bestimmte ausgewählte Ionen mit voreingestellten m/z-Werten durch den Quadrupol geleitet. Hierfür werden die für eine stabile Flugbahn durch den Quadrupol nötigen Gleich- und Wechselspannung nicht in einer Rampe verändert, sondern für die einzeln gewählten m/z Verhältnisse als fixe Werte nach und nach angelegt und so kontinuierlich abgearbeitet. Auch hierbei wird die Zeit für den Wechsel auf die jeweils folgenden Spannungswerte als Interscan-Delay bezeichnet. Man unterscheidet bei beiden Aufnahmemodi also zunächst grundsätzlich die Spannungseinstellzeit und die Aufnahmezeit (Passagezeit). Während ein Scan-Modus vergleichsweise viel Zeit für die Ausführung einer Spannungsrampe benötigt, kann im SIM-Modus wesentlich mehr Aufnahmezeit für die einzelnen (wenigen) selektierten m/z-Werte verwendet werden. Daneben werden im SIM-Modus eventuell störende Signale anderer m/z-Werte nicht aufgenommen und das Rauschen demzufolge verringert. Die Verringerung des Grundrauschens und die längere Datenaufnahmezeit pro Analyten ergeben zusammen im SIM-Modus eine üblicherweise höhere Sensitivität im Vergleich zum Scan-Modus. Allerdings ist das Spektrum dementsprechend nur aus den ausgewählten m/z-Werten zusammengesetzt und die Informationen nicht ausgewählter m/z-Werte gehen verloren. Zur Quantifizierung wird also häufig der SIM-Modus eingesetzt, wobei bei schnelleren Systemen durchaus auch eine Kombination von SIM und Scan verwendet werden kann, um innerhalb eines Messlaufes sowohl qualitative als auch quantitative Ergebnisse parallel zu erhalten.

Darstellung der Datenaufnahmeoptionen Scan und SIM

Troubleshooting

Hohes Hintergrundrauschen

Ein auffälliges Hintergrundrauschen ist häufig ein Anzeichen für Verunreinigungen bzw. Kontaminationen oder Matrixeffekte durch die Probe selbst. Daher muss zu Beginn die Ursache lokalisiert werden, um den richtigen Lösungsansatz zur Behebung des Problems zu finden.

Der einfachste Weg ist zunächst die Ursache einer möglichen Verunreinigung einzugrenzen. Hier unterstützen Sie Tabellen und Listen gängiger m/z-Werte (oder Online Recherchen). Durch den Abgleich der Störsignale mit denen in der Liste eingetragenen Massen, erhalten Sie entsprechende Hinweise auf die dazugehörigen Substanzen bzw. Kontaminanten.

Wenn durch eine solchen Tabelle eine Substanz ermittelt werden konnte, kann in den meisten Fällen auch schnell und simpel die Ursache gefunden werden, sei es beispielsweise in der Probenvorbereitung oder Lösemittelzusätze. ‭→ So sollte im besten Fall auf diese Komponente verzichtet werden und das LC-System gespült und ggf. die Ionenquelle einmal gereinigt werden.

Wartungs- und Reinigungsschritte Single Quadrupol MS am Beispiel des LCMS-2050

Das LCMS-2050 Single-Quadrupol MS ist besonders für Anfänger*innen im Bereich der Massenspektrometrie geeignet. Neben der einfachen Bedienung gehen auch die Wartungsschritte leicht von der Hand. Zur Reinigung des Quellenbereiches muss das System nicht belüftet werden und kann werkzeugfrei durchgeführt werden. Ein typischer Schritt hier ist die Reinigung oder Wechsel der Desolvation Line (DL). Diese dient als Einlass in das Massenspektrometer. Ebenfalls kann mit wenigen Handgriffen die ESI-Kapillare bei Bedarf getauscht werden.

Um die Reinigung der Fokussier- und Linsensysteme durchzuführen, muss das Gerät belüftet werden. Aber auch dieser Schritt ist simpel von den Anwender*innen selbst ausführbar. Nach dem Ausbau kann das gesamte Bauteil direkt mittels Ultraschallbad für 10 – 30 min in Methanol gereinigt werden.